一种非酒精性脂肪肝3D肝微球模型及其用途的制作方法

本发明涉及生物医学领域，特别是涉及一种非酒精性脂肪肝诱导培养基及其用途。

背景技术：

1、肝脏是重要而复杂的器官，参与蛋白质及脂肪代谢、胆汁制造、解毒、免疫调节等功能。非酒精性脂肪性肝病(nafld)现在被认为是世界范围内最常见的肝脏疾病之一，以肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征(脂肪占肝脏重量5％以上)，单纯性脂肪变性是一种相对良性的肝损伤状态，脂肪肝容易受到氧化应激、脂肪细胞凋亡和炎性细胞因子的进一步损伤，这些因素会导致非酒精性脂肪肝(nafl)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、肝硬化的发展。

2、一直以来，nafld发病机制和药物研究只要依赖体外细胞系和体内动物模型。体外细胞系作为基础研究，细胞所处的状态和组分与体内相差很大，无法真实模拟体内真实状态。药物或者饮食干预的方式获得动物模型成本极高，难以在短时间内实现高通量。随着技术的发展，近年来，3d模型在一定程度上解决了上述问题。肝球体是目前最常用的3d培养模型。球状体的形成是由肝细胞的自我聚集引起的，不需要非黏附表面和重力黏附等技术干预。

3、nafld世界上最常见的慢性肝病.全球范围nafld的发病率为25％，中国发病率为20％，我国预计有2-3亿nafld患者和3000多万nash患者。肥胖,ⅱ型糖尿病,高血脂高血压是nafld的三大危险因素，肥胖人群中nafld的发病率高达70％。随着肥胖和三高人群的不断增加，nafld患病率呈现上升趋势。非酒精性脂肪肝表现为特征性病变，包括从单纯的nafl变性到nash，然后导致部分肝脏发展为肝硬化，进一步恶化为肝细胞性肝癌(hcc)。美国的一项研究结果表明，nafld相关肝细胞癌占所有肝细胞癌的59％。

4、nafld的发病率高且后果严重,但到目前为止,美国食品药品管理局或欧洲药品管理局尚未批准任何药物治疗nafld，目前依然缺乏有效的药物来阻止或逆转nash患者的疾病进展，研究表明，从nafld到nash到肝硬化/肝衰竭及hcc的疾病进程，肝细胞内脂质堆积是nafld的重要启动事件，nafld-nash临床前体外模型的开发将为克服这些挑战铺平道路。

5、目前为止，大多数体外研究都利用二维单层肝细胞培养来阐明nafld所涉及的分子机制。二维单层肝细胞培养技术的优点是培养方法足够成熟，选择各种细胞和培养方法较为简单，然而不能长时间进行细胞培养，未能研究脂肪长期积累导致的变化，更为重要的是二维单层细胞培养不仅不能代表人类组织的复杂性，还缺乏关键的肝细胞－非实质细胞相互作用。

技术实现思路

1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种非酒精性脂肪肝诱导培养基及其用途，用于解决现有技术中的问题。

2、为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种非酒精性脂肪肝诱导培养基，所述非酒精性脂肪肝诱导培养基包含肝细胞基础培养基、单糖、脂肪酸和bsa，以所述非酒精性脂肪肝诱导培养基的总体积为基准，所述单糖的摩尔浓度为200-300μmol/；和/或，以所述非酒精性脂肪肝诱导培养基的总体积为基准，所述脂肪酸的摩尔浓度为150-250μmol/l；和/或，以所述非酒精性脂肪肝诱导培养基的总体积为基准，所述bsa的体积分数为0.5-1.5％。

3、优选地，所述非酒精性脂肪肝诱导培养基包含脂多糖。

4、本发明还提供前述非酒精性脂肪肝诱导培养基在制备3d非酒精性脂肪肝微球模型中的用途。

5、本发明还提供一种3d非酒精性脂肪肝微球模型的构建方法，所述构建方法包含如下步骤中的一种或多种：

6、1)将hep以及npc混合；

7、2)将步骤1)中混合后的细胞于超低吸附环境中培养，直到肝细胞微球形成；

8、3)将步骤2)中培养基更换为如前述非酒精性脂肪肝诱导培养基继续培养，直到3d非酒精性脂肪肝微球形成。

9、本发明还提供前述构建方法制备的3d非酒精性脂肪肝微球。

10、本发明还提供前述3d非酒精性脂肪肝微球在体外药物筛选中的用途。

11、本发明还提供一种非酒精性脂肪肝治疗药物的筛选方法，所述筛选方法包含如下步骤：

12、a)将待筛的非酒精性脂肪肝治疗药物与前述非酒精性脂肪肝诱导培养基混合后，培养前述3d非酒精性脂肪肝微球；

13、b)通过检测步骤a)培养后的3d非酒精性脂肪肝微球的细胞中如下一种或多种相关因子的变化：col1a1、pai1、sma、pdk4或甘油三酯，筛选非酒精性脂肪肝治疗药物。

14、如上所述，本发明的一种非酒精性脂肪肝诱导培养基及其用途，具有以下有益效果：

15、(1)本发明针对药物研发早期活性评价缺乏合适的体外模型的瓶颈问题，采用多学科交叉的研究方法，以3d肝微球技术为核心，创新性地构建3d非酒精性脂肪肝微球模型，经验证表明该模型适用于药物生物活性评价，有效筛选具有缓解非酒精性脂肪肝病症的候选药物。

16、(2)本发明采用的细胞评价模型，相比动物实验，实验流程及操作更加简单，实验周期显著缩短，成本更低。

技术特征：

1.一种非酒精性脂肪肝诱导培养基，其特征在于，所述非酒精性脂肪肝诱导培养基包含肝细胞基础培养基、单糖、脂肪酸和bsa，以所述非酒精性脂肪肝诱导培养基的总体积为基准，所述单糖的摩尔浓度为200-300μmol/；和/或，以所述非酒精性脂肪肝诱导培养基的总体积为基准，所述脂肪酸的摩尔浓度为150-250μmol/l；和/或，以所述非酒精性脂肪肝诱导培养基的总体积为基准，所述bsa的体积分数为0.5-1.5％。

2.根据权利要求1所述的非酒精性脂肪肝诱导培养基，其特征在于，所述非酒精性脂肪肝诱导培养基包含脂多糖，以所述非酒精性脂肪肝诱导培养基的总体积为基准，所述脂多糖的浓度为5-15ng/ml。

3.根据权利要求1所述的非酒精性脂肪肝诱导培养基，其特征在于，所述单糖选自甘油醛、赤藓糖、苏力糖、阿拉伯糖、核糖、木糖、来苏糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖中的一种或多种；和/或，所述脂肪酸选自月桂酸、桐油酸、油酸、棕榈酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸中的一种或多种；优选地，所述单糖选自葡萄糖或果糖中的一种或多种；和/或，所述脂肪酸选自油酸或棕榈酸中的一种或多种。

4.如权利要求1-3任一所述的非酒精性脂肪肝诱导培养基在制备非酒精性脂肪肝3d肝微球模型中的用途。

5.一种3d非酒精性脂肪肝微球模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包含如下步骤：

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法包含如下特征中的一种或多种：

7.如权利要求5或6所述构建方法制备的非酒精性脂肪肝3d肝微球。

8.如权利要求7所述的非酒精性脂肪肝3d肝微球在体外药物筛选中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述药物选自如下的一种或多种：

10.一种非酒精性脂肪肝治疗药物的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包含如下步骤：

技术总结本发明涉及生物医学领域，特别是涉及一种非酒精性脂肪肝诱导培养基及其用途。本发明提供的非酒精性脂肪肝诱导培养基包含肝细胞基础培养基、单糖、脂肪酸和牛血清白蛋白。本发明提供的非酒精性脂肪肝3D肝微球模型适用于药物生物活性评价，可以有效筛选具有缓解非酒精性脂肪肝病症的候选药物。本发明采用的细胞评价模型，相比动物实验，实验流程及操作更加简单，实验周期显著缩短，成本更低。技术研发人员：瞿敏敏,李欣,陈双,黄彬璐受保护的技术使用者：妙顺（上海）生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/18