一种蔗糖磷酸化酶的工程改造及应用

本发明涉及一种蔗糖磷酸化酶的工程改造及应用，属于酶工程改造领域。

背景技术：

1、抗坏血酸(l-aa)作为生活中常见的维生素c为大家所熟知，我们主要通过从外界蔬菜水果、补剂中摄入来补充这种维生素。l-aa作为人体健康所必需的重要营养元素，具有抗氧化、保护神经、提高免疫力、美白等功效。但由于l-aa在氧气、光、热、水分、金属离子等条件下极其不稳定，且l-aa的过度吸收会导致细胞毒性，也导致我们想要长期、稳定地应用l-aa受到了极大限制。为了找寻兼具l-aa性能且稳定的替代物质，人们做出了很多尝试，抗坏血酸葡萄糖苷(aa-2g)正是在这时走入人们的视野。作为l-aa的糖苷化合物，aa-2g也是aa的稳定前药。相较于其他l-aa衍生物，aa-2g具有绝佳的稳定性和可溶解性。合成aa-2g主要通过化学合成和生物转化。早年间人们把合成aa-2g的重心放在化学合成上。化学合成虽省时快速，但由于其步骤繁琐和不可持续性，在近几年已逐渐被生物酶法合成法所取代。酶法合成aa-2g胜在反应条件温和、底物价廉易得，相较于传统的化学方法，酶催化具有更突出的特异性和更高的产率。蔗糖磷酸化酶(spase)是酶法合成aa-2g的常用酶之一，用spase对部分化合物进行转糖基化，可显著改善该化合物的溶解度和生物利用性，然而由于蔗糖磷酸化酶对这些化合物的亲和力很低，其底物滥交性也使得转糖基化反应和水解反应间存在竞争，在工业上的应用受到限制。

技术实现思路

1、[技术问题]

2、现有技术中长双歧杆菌来源的蔗糖磷酸化酶的转糖基酶活力低，催化合成抗坏血酸葡萄糖苷时，产量、转化率低。

3、[技术方案]

4、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种蔗糖磷酸化酶突变体，所述突变体的转糖基比酶活明显提升。将突变体用于抗坏血酸葡萄糖苷的生产中，抗坏血酸葡萄糖苷的产量成功达到1.06m。

5、本发明的第一个目的是提供一种蔗糖磷酸化酶，所述蔗糖磷酸化酶以seq idno.1所示的氨基酸序列为出发序列，对出发序列进行了如下(a)-(c)任一所示的突变：

6、(a)将341位亮氨酸突变为缬氨酸或异亮氨酸；

7、(b)将345位谷氨酰胺突变为甲硫氨酸或丙氨酸；

8、(c)将346位缬氨酸突变为脯氨酸、丙氨酸或半胱氨酸。

9、在一种实施方式中，所述蔗糖磷酸化酶以seq id no.1所示的氨基酸序列为出发序列，对出发序列进行了包括如下(d)-(g)任一所示的突变：

10、(d)将第341位亮氨酸突变为缬氨酸，且第345位谷氨酰胺突变为甲硫氨酸或丙氨酸；

11、(e)将第341位亮氨酸突变为缬氨酸，且第346位缬氨酸突变为丙氨酸或脯氨酸；

12、(f)将第341位亮氨酸突变为异亮氨酸，且第345位谷氨酰胺突变为甲硫氨酸或丙氨酸；

13、(g)将第341位亮氨酸突变为异亮氨酸，且第346位缬氨酸突变为丙氨酸或半胱氨酸。

14、在一种实施方式中，所述蔗糖磷酸化酶以seq id no.1所示的氨基酸序列为出发序列，将出发序列第341位亮氨酸突变为缬氨酸，并且对出发序列进行了包括如下(h)或(i)所示的突变：

15、(h)将第345位谷氨酰胺突变为甲硫氨酸，且第346位缬氨酸突变为丙氨酸；

16、(i)将第345位谷氨酰胺突变为丙氨酸，且第346位缬氨酸突变为丙氨酸或半胱氨酸或脯氨酸。

17、本发明的第二个目的是提供编码上述蔗糖磷酸化酶的多核苷酸。

18、本发明的第三个目的是提供携带上述多核苷酸的载体。

19、在一种实施方式中，所述载体可以是质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒、病毒、yac载体、穿梭载体等任意的载体。

20、本发明的第四个目的是提供携带上述多核苷酸或载体，或上述蔗糖磷酸化酶的细胞。

21、在一种实施方式中，所述重组细胞的宿主细胞可以是植物细胞、动物细胞或微生物细胞，作为选择的举例，没有限定，所述微生物细胞可以是大肠杆菌或枯草芽孢杆菌。

22、本发明的第五个目的是提供一种生产抗坏血酸葡萄糖苷的方法，所述方法包括：将底物与上述蔗糖磷酸化酶混合反应；所述底物含有抗坏血酸和蔗糖。

23、在一种实施方式中，所述反应的温度为≤65℃，可选为30-65℃。

24、在一种实施方式中，所述反应的ph为4.0-6.0。

25、在一种实施方式中，以水解酶活计算，所述反应体系中的糖磷酸化酶添加量为大于2u/ml，可选为2-12u/ml。

26、在一种实施方式中，在反应的12-36h相体系中补料蔗糖，补料浓度不低于0.2m。

27、本发明的第六个目的是提供上述蔗糖磷酸化酶，或上述多核苷酸，或上述载体，或上述细胞，或上述方法在食品、医药、或化工领域中的应用。

28、在一种实施方式中，所述应用包括：利用所述蔗糖磷酸化酶，或所述多核苷酸，或所述载体，或所述细胞，或所述方法生产抗坏血酸葡萄糖苷或含抗坏血酸葡萄糖苷的产品。

29、有益效果：

30、本发明通过对蔗糖磷酸化酶进行改造，得到了一系列转糖基酶活力提升的突变体，其中突变体l341v/v346p的转糖基比酶活力提升最大，是野生型的3.24倍。将该突变体用于抗坏血酸葡萄糖苷的放大生产，在酶添加量为8u/ml的条件下，抗坏血酸葡萄糖苷产量比野生型提升了0.38m，l-aa转化率达到了75.7％。

技术特征：

1.一种蔗糖磷酸化酶，其特征在于，所述蔗糖磷酸化酶以seq id no.1所示的氨基酸序列为出发序列，对出发序列进行了如下(a)-(c)任一所示的突变：

2.根据权利要求1所述的蔗糖磷酸化酶，其特征在于，所述蔗糖磷酸化酶以seq idno.1所示的氨基酸序列为出发序列，对出发序列进行了如下(d)-(g)任一所示的突变：

3.根据权利要求1所述的蔗糖磷酸化酶，其特征在于，所述蔗糖磷酸化酶以seq idno.1所示的氨基酸序列为出发序列，将出发序列第341位亮氨酸突变为缬氨酸，并且对出发序列进行了如下(h)或(i)所示的突变：

4.编码权利要求1-3任一所述蔗糖磷酸化酶的多核苷酸。

5.携带权利要求4所述多核苷酸的载体。

6.表达权利要求1-3任一所述蔗糖磷酸化酶，或携带权利要求4所述多核苷酸或权利要求5所述载体的细胞。

7.根据权利要求6所述的细胞，其特征在于，所述细胞为动物细胞或微生物细胞。

8.一种生产抗坏血酸的方法，其特征在于，所述方法包括：将底物与权利要求1-3任一所述蔗糖磷酸化酶混合反应；所述底物含有抗坏血酸和蔗糖。

9.权利要求1-3所述的蔗糖磷酸化酶，或权利要求4所述的多核苷酸，或权利要求5所述的载体，或权利要求6或7所述的细胞，或权利要求8所述的方法在食品、医药或化工领域中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括：利用所述蔗糖磷酸化酶，或所述多核苷酸，或所述载体，或所述细胞，或所述方法生产抗坏血酸葡萄糖苷或含抗坏血酸葡萄糖苷的产品。

技术总结本发明公开了一种蔗糖磷酸化酶的工程改造及应用，属于酶工程改造领域。本发明通过饱和诱变，建立了突变体文库。经单点和复合突变，鉴定出L341V/V346P为阳性突变体。该突变体用于抗坏血酸葡萄糖苷的合成时，产量及转化率都显示出了明显的提升，为工业生产提高抗坏血酸葡萄糖苷转化率和大规模应用奠定基础。技术研发人员：陈献忠,沈雨娟,夏媛媛,杨海泉,沈微,曹钰受保护的技术使用者：江南大学技术研发日：技术公布日：2024/6/18