检测核酸的组合、方法及试剂盒与流程

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及核酸的检测。

背景技术：

1、长期以来，组织病理学诊断是肿瘤诊断的金标准和临床治疗的基础。然而病理组织较难获得，取样较为不便，且难以连续取样对肿瘤患者的基因突变情况进行持续监测。因此通过检测患者外周血中的循环肿瘤dna(ctdna)的基因突变可以实现对肿瘤患者的早期筛查、用药指导、预后判断以及复发监测。但由于外周血样本背景复杂，ctdna含量稀少，因此对于低丰度以及稀有序列的检测，需要特异性和灵敏度极高的检测方法及检测试剂盒。

2、目前现有的基因突变检测试剂，多采用taqman水解探针法或是扩增阻滞系统(amplification refractory mutation system，arms)。其中taqman水解探针法方法需要设计一对特异性的pcr引物和一条与模版互补的特异性探针，且探针的结合位点位于两条引物之间，探针上5′端和3′端分别标记了一个荧光基团(供体)和一个淬灭基团(受体)，当taqman探针呈完整的游离状态时，荧光基团与淬灭基团相距较近，淬灭基团会吸收荧光基团在激发光作用下的激发荧光，发生荧光共振能量转移(fluorescence resonance energytransfer，fret)，从而导致仪器检测不到荧光信号；在pcr扩增过程中，taq dna聚合酶利用其5’-3’核酸外切酶活性切割与靶序列结合的探针，荧光报告基团和淬灭基团相距变远，从而释放出荧光信号。

3、另一方面，arms法利用dna聚合酶缺乏3’外切酶活性的特点，如果引物的3’末端碱基不能与靶核酸序列正确的互补配对，那么靶核酸序列就不能被有效的扩增。理论上在进行基因突变检测时，需要一条通用探针与之配合的突变型引物和野生型引物，其中突变型引物的3’末端与突变型基因完全匹配，但与野生型基因不匹配。在进行突变基因检测时，由于突变型引物与野生型模板不能完全配对，引物的延伸被阻滞，从而实现突变基因的检测。

4、在针对肿瘤患者外周血ctdna进行液体活检时，由于ctdna呈高度片段化，其片段长度分布在90bp-160bp之间，既往研究发现当靶序列长度越短时，ctdna的检出率越高(anderson et al.，2015)。但当前的ctdna检测技术无论是采用taqman水解探针法还是arms法，都存在靶序列过长的问题。如专利cn105349654b所述的一种用于检测egfr基因突变的探针、引物、检测体系及试剂盒，其检测egfr突变基因所需的靶序列长度在70bp-134bp之间，其中外显子18上的突变位点检测所需的扩增靶序列长度为100bp-116bp，外显子19上的突变位点检测所需的扩增靶序列长度为70bp-84bp，外显子20上的突变位点检测所需的扩增靶序列长度为85bp-134bp，外显子21上的突变位点检测所需的扩增靶序列长度为109bp-121bp。较长的扩增靶序列长度势必会降低片段化ctdna模板的检出率，从而影响检测灵敏度。

5、此外，目前arms法中的突变型引物往往无法完全阻滞非特异性的模板扩增，在检测时容易产生假阳性的结果，尤其是在终点检测的系统如数字pcr系统中，突变型和野生型的在扩增终点时的荧光信号往往很难区分，因此导致检测的特异性不足。

6、据此，在基因检测领域，存在着进一步改善核酸检测灵敏度和特异性的需求。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明人基于arms法对其引物和探针设计方式进行研究，从而完成了本发明。

2、一方面，本发明提供了用于检测核酸的组合，包括：

3、上游引物，其3’端设置有靶序列结合区，所述靶序列结合区的3’末端能够与靶序列的特异检测位点互补；

4、下游引物，其3’端设置有靶序列结合区，所述靶序列结合区的3’末端也能够与同一特异检测位点互补；和

5、信号寡核苷酸，所述信号寡核苷酸修饰有第一检测基团和第二检测基团，其中，所述第一检测与第二检测基团通过距离的变化产生信号的变化，

6、其中，所述信号寡核苷酸被设计成所述上游引物和/或下游引物的一部分且位于所述靶序列结合区的上游；或者，所述上游引物和/或下游引物在靶序列结合区的上游进一步包括信号检测区，所述信号寡核苷酸被设计成独立于所述上游引物和/或下游引物且与所述信号检测区具有相同的序列，

7、并且其中，所述信号检测区被设计成不能与靶序列发生互补配对。

8、通过采用这样的设计，本发明取得了以下有益效果：

9、一方面，在使用信号寡核苷酸代替靶序列特异性探针的基础上，本发明在上游引物与下游引物两者的3’末端均与靶序列上的某个特异检测位点相匹配。两种方式相互配合，使得对靶序列长度的需求降低到理论上的最低值如下文实施例中所证实，靶序列的长度可不超过40bp。如前文所述，在高度片段化核酸样本(如ctdna)的检测中，更短的靶序列长度拥有更高的检出率，从而大大提高检测的灵敏度。

10、另一方面，本发明的组合以及反应体系可以良好地避免交叉反应，例如，在检测突变型靶核酸序列时，无野生型或其它相近或具有同源性的靶核酸交叉反应。尤其在同时检测野生型与突变型时，两者交叉反应小，更有利于稀有突变的检测。

11、又一方面，本发明的组合可用于检测小于100bp的短片段dna，可以适用于多种样本类型的核酸检测。

12、再一方面，本发明的组合可在一个反应管中同时检测突变型与野生型靶核酸序列，无需分管定性检测或定量检测野生型和突变型基因，特别适合用于稀少样本，如外周血ctdna样本的检测。

13、在一些实施方式中，本发明的组合的各引物对被设计成针对不同的基因突变类型。在信号寡核苷酸被设计成引物的一部分的情况下，各引物对所对应的信号寡核苷酸探针可彼此相同，但它们的靶序列结合区与不同的突变型基因互补。在信号寡核苷酸独立于引物存在的情况下，各引物对的信号检测区可彼此相同，但它们的靶序列结合区与不同的突变型基因互补。类似地，本发明的组合还可以包括额外的多组引物对。

14、通过利用多组上游引物以及下游引物的靶序列结合区特异性识别多种靶标，然后由信号寡核苷酸进行检测。在多重检测中，针对无需分型的基因突变类型，只需设计不同的上游引物及下游引物，可以共用信号寡核苷酸，即可实现不同基因突变类型的检测，减少探针的使用量。一方面，可以节约成本，利于临床使用；另一方面，可以显著降低反应体系内因探针数量过多造成的背景干扰。

15、在一些实施方式中，所述组合进一步包括能够特异性靶向其他核酸的上游引物和/或下游引物。例如，在本发明的组合的上游引物和下游引物被设计成针对突变型基因的情况下，即，上游引物和下游引物的3’末端均与靶序列上的特异检测位点(即，由于突变所引起待检测的突变型基因区别于其他基因的位点)相匹配，能够扩增突变型基因；进一步地，本发明的组合还包括野生型上游引物，所述野生型上游引物3’末端设置有与野生型基因匹配的位点，能够特异性地与野生型基因退火，和/或野生型下游引物，所述野生型下游引物3’末端设置有与野生型基因匹配的位点，能够特异性地与野生型基因退火。

16、在一些实施方式中，本发明的靶序列结合区可设置有1-5个错配碱基，其不与靶序列互补配对。例如，在靶序列结合区的3’末端倒数第2位或第3位上可设置有错配碱基。

17、在第一方式中，本发明的组合包括：

18、上游引物，其3’端设置有靶序列结合区，所述靶序列结合区的3’末端能够与靶序列的特异检测位点互补；

19、下游引物，其3’端设置有靶序列结合区，所述靶序列结合区的3’末端也能够与同一特异检测位点互补；和

20、信号寡核苷酸，所述信号寡核苷酸被设计成自5’至3’依次包括第一茎(stem)区、环(loop)区、第二茎区和锚定(anchor)区，并且修饰有第一检测基团和第二检测基团，其中，所述第一检测基团修饰在所述第一茎区上，所述第二检测基团修饰在所述第二茎区上、所述第二茎区与锚定区之间或所述锚定区的非3’末端，所述第一检测基团与第二检测基团通过距离的变化产生信号的变化，

21、其中，所述上游引物和/或下游引物在靶序列结合区的上游包括信号检测区，所述信号检测区被设计成不能与靶序列发生互补配对，

22、其中，所述第一茎区被设计成与第二茎区部分或完全互补，所述锚定区位于所述信号寡核苷酸的3’端且被设计成与所述信号检测区完全或部分相同。

23、可以理解，由于锚定区被设计成与信号检测区完全或部分相同，其能够与信号检测区的互补序列进行退火并延伸，从而对上游引物和下游引物的扩增产物进行扩增。另外，第一茎区被设计成与第二茎区部分或完全互补，从而能够与第二茎部一起构成茎环的茎部。

24、当使用第一方式的组合时，第一茎区与第二茎区互补，构成茎环的茎部，当信号寡核苷酸呈完整的“茎环”结构时，第一检测基团与第二检测基团距离较近，荧光共振能量转移效率较高；当信号寡核苷酸的第一茎区被dna聚合酶的5’-3’外切酶活性水解，或信号寡核苷酸的“茎环”结构被打开时，第一检测基团与第二检测基团之间的距离变远，荧光共振能量转移效率降低，导致荧光信号产生变化，从而被仪器检测到。

25、在一些实施方式中，本发明的信号寡核苷酸能够形成″茎环″结构，该茎环结构在本发明的引物的退火温度下(如高至75℃的情况下)仍具有稳固的结构(即，″茎环″不会被打开)。

26、在本发明中，第一茎区的长度可以是6-20nt。

27、在本发明中，第二茎区的长度可以是6-20nt。

28、在本发明中，环区例如可以是长度为3-25nt的碱基序列，又例如可以是选自由c3、c6、c9和c12所组成的组的间臂修饰，再例如可以选自聚乙二醇。

29、在本发明中，第二茎区与锚定区之间可以存在0-5个碱基间隔。

30、在具体的实施方式中，锚定区的长度可以是15-30nt。

31、在示例性的实施方式中，第一检测基团可位于第一茎区，而第二检测基团可位于所述第二茎区；第一检测基团可位于第一茎区，而第二检测基团可位于锚定区的非3’末端；第一检测基团可位于第一茎区，而第二检测基团可位于第二茎区和锚定区之间；第二检测基团可位于第一茎区，而第一检测基团可位于第二茎区；第二检测基团可位于第一茎区，而第一检测基团可位于锚定区的非3’末端；或者第二检测基团可位于第一茎区，而第一检测基团可位于第二茎区和锚定区之间。

32、在一些实施方式中，第一检测基团或第二检测基团可位于第一茎区的5’端。

33、在第二方式中，本发明的组合包括：

34、上游引物，其3’端设置有靶序列结合区，所述靶序列结合区的3’末端能够与靶序列的特异检测位点互补；

35、下游引物，其3’端设置有靶序列结合区，所述靶序列结合区的3’末端能够与同一特异检测位点互补；和

36、信号寡核苷酸，所述信号寡核苷酸被设计成柔性寡核苷酸，其全部或部分序列与信号检测区相同，并且所述信号寡核苷酸修饰有第一检测基团和第二检测基团，其中，所述第一检测基团与第二检测基团通过距离的变化产生信号的变化，所述第一检测基团和第二基团位于所述信号寡核苷酸的非3’末端，

37、其中，所述信号检测区位于上游引物和/或下游引物的靶序列结合区的上游，并且所述信号检测区被设计成不能与靶序列发生互补配对。

38、可以理解，由于信号寡核苷酸被设计成与信号检测区完全或部分相同，其能够与信号检测区的互补序列进行退火并延伸，从而对上游引物和下游引物的扩增产物进行扩增。

39、当使用第二方式的组合时，上游引物及下游引物与靶序列特异性结合并延伸产生预扩增产物后，信号寡核苷酸可与预扩增产物互补配对并进行pcr扩增，将第一检测基团与第二检测基团整合入pcr产生的双链扩增产物中，使得第一检测基团与第二检测基团的距离发生变化，导致荧光信号发生变化，从而被仪器检测到。

40、在具体的实施方式中，信号寡核苷酸的长度可以是15-30nt。

41、在示例性的实施方式中，第一检测基团位于5’端或任意非3’末端的位置，而第二检测基团与第一检测基团间隔5-25nt且未位于3’末端。

42、在第三方式中，本发明的组合包括：

43、上游引物，其3’端设置有靶序列结合区，所述靶序列结合区的3’末端能够与靶序列的特异检测位点互补；

44、下游引物，其3’端设置有靶序列结合区，所述靶序列结合区的3’末端能够与同一特异检测位点互补；

45、信号寡核苷酸，所述信号寡核苷酸的全部或部分序列与信号检测区相同，并且修饰有第一检测基团和第二检测基团，其中，所述第一检测基团与第二检测基团通过所述信号寡核苷酸水解所产生的距离的变化产生信号的变化；和

46、第二引物，所述第二引物的全部或部分序列与信号检测区相同，

47、其中，所述信号检测区位于上游引物和/或下游引物的靶序列结合区的上游，所述信号检测区被设计成不能与靶序列发生互补配对，并且所述信号检测区上与所述信号寡核苷酸相同的区域位于与所述第二引物相同的区域的下游。

48、可以理解，在该方式中，信号寡核苷酸为taqman探针，其能够与信号检测区的互补序列进行杂交配对；另外，由于第二引物被设计成与信号检测区完全或部分相同，其能够与信号检测区的互补序列进行退火并延伸，从而对上游引物和下游引物的扩增产物进行扩增。

49、当使用第三方式的组合时，上游引物及下游引物与靶序列特异性结合并延伸产生预扩增产物后，第二引物以及信号寡核苷酸可与预扩增产物互补配对，由第二引物进行延伸时，会将信号寡核苷酸水解并释放第一检测基团，导致荧光信号发生变化，从而被仪器检测到。

50、本领域技术人员能够设计并选择合适的第二引物，只要能够对上游引物和下游引物的预扩增产物进行扩增即可。

51、对于本发明第三方式中的信号寡核苷酸，本领域技术人员能够按照常规taqman水解探针的设计原则进行设计，只要杂交区域位于信号检测区的互补区域即可。

52、在一个具体的实施方式中，第一检测基团和第二检测基团分别位于信号寡核苷酸的5’末端和3’末端。

53、在第四方式中，本发明的组合包括：

54、上游引物，其3’端设置有靶序列结合区，所述靶序列结合区的3’末端能够与靶序列的特异检测位点互补；

55、下游引物，其3’端设置有靶序列结合区，所述靶序列结合区的3’末端能够与同一特异检测位点互补；和

56、信号寡核苷酸，所述信号寡核苷酸修饰有第一检测基团和第二检测基团，其中，所述第一检测基团与第二检测基团通过距离的变化产生信号的变化，

57、其中，所述信号寡核苷酸被设计成所述上游引物和/或下游引物的一部分且位于靶序列结合区的上游，所述信号寡核苷酸自5’至3’依次包括第一茎区、环区和第二茎区，其中，所述第一检测基团位于所述第一茎区，而所述第二检测基团位于所述第二茎区，

58、并且其中，所述第一茎区被设计成与第二茎区部分或完全互补。

59、可以理解，第一茎区被设计成与第二茎区部分或完全互补，从而能够与第二茎部一起构成茎环的茎部。

60、当使用第四方式的组合时，在信号寡核苷酸呈完整的“茎环”结构的情况下，第一检测基团与第二检测基团距离较近，荧光共振能量转移效率较高；在第一茎区被dna聚合酶的5’-3’外切酶活性水解，或信号寡核苷酸的“茎环”结构被打开时，第一检测基团与第二检测基团之间的距离变远，荧光共振能量转移效率降低，导致荧光信号产生变化，从而被仪器检测到。

61、通过将信号寡核苷酸设计在上游引物和/或下游引物内，本发明进一步节省了传统arms法中探针的使用，在满足检测性能的同时降低了成本。

62、在示例性的实施方式中，第一检测基团可位于第一茎区，而第二检测基团可位于所述第二茎区；或者第二检测基团位于第一茎区，而第一检测基团位于第二茎区。

63、此外，本发明还提供了一种检测核酸的方法，包括以下步骤：

64、将本发明的组合、扩增试剂与样本混合；

65、对样本中可能存在的靶序列进行扩增；

66、获得所产生的信号变化；以及

67、根据所获得信号变化判断样本中是否存在靶核酸。

68、在具体的实施方式中，在判断样本中是否存在靶核酸的同时对靶核酸进行定量。

69、在一些实施方式中，在扩增步骤之前还包括将样本混合物分配到不同的反应单元中的步骤双链核酸变性为单链；任选地，在分配到不同的反应单元之前，还可以包括将双链核酸变性为单链核酸的步骤。

70、具体地，根据所获得的荧光信号判断是指检测第一检测基团与第二检测基团之间的荧光共振能量转移存在或不存在。

71、在具体的实施方式中，扩增包括是指通过pcr进行扩增，例如可包括预变性；变性、退火及延伸的多个循环。

72、在优选的实施方式中，所述待测模板为ctdna且所述样本为外周血。

73、在一些实施方式中，所述样本来自患有癌症或怀疑患有癌症的受试者。