KCNQ1、KCNH2、SCN5A、KCNJ2、CAV3基因检测试剂盒及使用方法与流程

本发明涉及基因检测领域，特别涉及kcnq1、kcnh2、scn5a、kcnj2、cav3基因检测试剂盒及使用方法。

背景技术：

1、遗传性长qt综合征(long qt syndrome，lqts)是一种心脏结构正常但心肌复极延迟的单基因遗传性心血管疾病，主要表现为心电图校正的qt间期(qtc)延长，易发尖端扭转型室速导致晕厥甚至心脏性猝死(sudden cardiac death,scd)。目前报道lqts明确的致病基因9个，分别编码电压门控钾、钠、钙通道蛋白及其相关调节蛋白，而lqts的亚型有15种，其中kcnq1、kcnh2和scn5a 3个致病基因可解释约75％的患者，kcnj2和cav3致病基因大约可解释5％-10％的患者。kcnq1基因编码人类心肌钾通道蛋白的β亚单位，其基因突变可引起lange nielsen综合征和长qt综合症；kcnh2基因即herg(the human ether-à-go-go-related gene)，编码人类心肌快速激活延迟整流钾通道(ikr)的α亚基，是长qt综合症和短qt综合症的致病基因之一；scn5a基因负责编码钠通道蛋白的ɑ亚单位，是长qt综合症、brugada综合征、扩张型心肌病、病态窦房结综合征、心脏传导疾病的致病基因；kcnj2基因编码内向钾通道蛋白kir 2.1，kcnj2蛋白由包含选择性孔区域的两个跨膜结构域组成，临床表现有周期性麻痹，qt间期延长的室性心律失常和脊柱弯曲、趾弯曲等畸形特征；cav3基因位于细胞膜微囊内，cav3基因突变，cav3与钠通道蛋白的ɑ亚单位(nav1.5)相互作用，晚钠电流明显增大导致lqts。此外，其余致病基因和致病机制仍不断被发现。

2、目前，诊断和治疗lqts多在临床阶段。在临床上，lqts的诊断主要根据患者的临床特征、家族史和心电图表现进行判断，这种方式的主要缺陷在于临床诊断通常是在患者出现症状后再进行，难以预防lqts，并且存在相当一部分病例无法诊断。而lqts一旦发病，十分危急，死亡率高，大多来不及诊断。因此，相比临床诊断lqts，通过分析致病基因型别，寻找lqts易患人群，并提前预防lqts的发生更为重要。由于lqts有多个亚型，突变位点多且繁杂，因此鉴别、预测其基因类型的基因鉴定方法开发十分困难。现有的基因鉴定方法多是基因测序法和实时荧光pcr法，二者均存在缺陷。例如基因测序法在pcr后处理操作步骤繁琐，对技术人员要求较高，成本高，不适合大范围推广；实时荧光pcr法通量不高，成本高，主要适于对少量位点、大样本进行分型，且只能检测特定基因的snp位点。基于荧光pcr熔解曲线法的检测技术，可以同时测定多个高频突变基因，因此，开发基于荧光pcr熔解曲线法lqts检测技术，成为体外快速定性检测lqts突变基因和预测lqts最有前景的手段。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种人类kcnq1、kcnh2、scn5a、kcnj2和/或cav3基因的检测方法。

2、本发明的另一目的在于用于检测人类kcnq1、kcnh2、scn5a、kcnj2和/或cav3基因的pcr引物对集。

3、本发明的另一目的在于用于检测人类kcnq1、kcnh2、scn5a、kcnj2和/或cav3基因的引物探针混合液。

4、本发明的另一目的在于用于检测人类kcnq1、kcnh2、scn5a、kcnj2和/或cav3基因的试剂盒及其使用方法。

5、为解决上述技术问题，本发明第一方面，提供了一种用于检测人类kcnq1、kcnh2、scn5a、kcnj2和/或cav3基因的pcr引物对集，所述pcr引物对集包括：

6、第一引物对组，所述第一引物对组包括第一引物对、第二引物对、第三引物对和/或第五引物对；

7、和/或，第二引物对组，所述第二引物对组包括第四引物对、第八引物对和/或第十引物对；

8、和/或，第三引物对组，所述第三引物对组包括第六引物对、第七引物对和/或第九引物对；

9、其中，所述第一引物对(特异性检测kcnq1的254位点突变密码子)，所述第一引物对包括如seq id no.:1所示的正向引物；和，如seq id no.:2所示的反向引物；和/或

10、所述第二引物对(特异性检测kcnq1的269位点突变密码子)，所述第二引物对包括如seq id no.:3所示的正向引物；和，如seq id no.:4所示的反向引物；和/或

11、所述第三引物对(特异性检测kcnq1的341位点突变密码子)，所述第三引物对包括如seq id no.:5所示的正向引物；和，如seq id no.:6所示的反向引物；和/或

12、所述第四引物对(特异性检测kcnh2的552位点突变密码子)，所述第四引物对包括如seq id no.:10所示的正向引物；和，如seq id no.:11所示的反向引物；和/或

13、所述第五引物对(特异性检测kcnh2的561位点突变密码子)，所述第五引物对包括如seq id no.:12所示的正向引物；和，如seq id no.:13所示的反向引物；和/或

14、所述第六引物对(特异性检测kcnh2的613、614位点突变密码子)，所述第六引物对包括如seq id no.:14所示的正向引物；和，如seq id no.:15所示的反向引物；和/或

15、所述第七引物对(特异性检测scn5a的367位点突变密码子)，所述第七引物对包括如seq id no.:19所示的正向引物；和，如seq id no.:20所示的反向引物；和/或

16、所述第八引物对(特异性检测scn5a的1784位点突变密码子)，所述第八引物对包括如seq id no.:23所示的正向引物；和，如seq id no.:24所示的反向引物；和/或

17、所述第九引物对(特异性检测kcnj2的67位点突变密码子)，所述第九引物对包括如seq id no.:7所示的正向引物；和，如seq id no.:8所示的反向引物；和/或

18、所述第十引物对(特异性检测cav3的97位点突变密码子)，所述第十引物对包括如seq id no.:25所示的正向引物；和，如seq id no.:26所示的反向引物。

19、在一些优选的方案中，所述pcr引物对集包括第一引物对组，并任选包括至少一组选自第二引物对组、第三引物对组、第四引物对组和第五引物对组的引物对组。

20、在一些优选的方案中，所述pcr引物对集包括第二引物对组，并任选包括至少一组选自第一引物对组、第三引物对组、第四引物对组和第五引物对组的引物对组。

21、在一些优选的方案中，所述pcr引物对集包括第三引物对组，并任选包括至少一组选自第一引物对组、第二引物对组、第四引物对组和第五引物对组的引物对组。

22、在一些优选的方案中，所述pcr引物对集包括第一引物对组、第二引物对组和第三引物对组，并包括第四引物对组和第五引物对组中的至少一种。

23、在一些优选的方案中，所述pcr引物对集包括第一引物对组、第二引物对组、第三引物对组、第四引物对组和第五引物对组。

24、在一些优选的方案中，所述第一引物对组包括第一引物对，并任选包括至少一组选自第二引物对和第三引物对组的引物对。

25、在一些优选的方案中，所述第一引物对组包括第二引物对，并任选包括至少一组选自第一引物对和第三引物对组的引物对。

26、在一些优选的方案中，所述第一引物对组包括第三引物对，并任选包括至少一组选自第一引物对和第二引物对组的引物对。

27、在一些优选的方案中，所述第二引物对组包括第四引物对，并任选包括至少一组选自第五引物对和第六引物对组的引物对。

28、在一些优选的方案中，所述第二引物对组包括第五引物对，并任选包括至少一组选自第四引物对和第六引物对组的引物对。

29、在一些优选的方案中，所述第二引物对组包括第六引物对，并任选包括至少一组选自第四引物对和第五引物对组的引物对。

30、本发明的第二方面，提供了一种用于检测人类kcnq1、kcnh2、scn5a、kcnj2和/或cav3基因的引物探针混合液，所述引物探针混合液包括本发明第一方面所述的pcr引物对组集和探针集，所述探针集包括选自下组的一个或多个探针组；

31、第一探针组，所述第一探针组包括第一探针、第二探针、第三探针和第五探针中的至少一种；

32、第二探针组，所述第二探针组包括第四探针、第八探针和第十探针中的至少一种；

33、第三探针组，所述第三探针组包括第六探针、第七探针和第九探针中的至少一种；

34、其中，所述第一探针，特异性靶向kcnq1的254位点突变密码子；

35、所述第二探针，特异性靶向kcnq1的269位点突变密码子；

36、所述第三探针，特异性靶向kcnq1的341位点突变密码子；

37、所述第四探针，特异性靶向kcnh2的552位点突变密码子；

38、所述第五探针，特异性靶向kcnh2的561位点突变密码子；

39、所述第六探针，特异性靶向kcnh2的613、614位点突变密码子；

40、所述第七探针，特异性靶向scn5a的367位点突变密码子；

41、所述第八探针，特异性靶向scn5a的1784位点突变密码子；

42、所述第九探针，特异性靶向kcnj2的67位点突变密码子；和

43、所述第十探针，特异性靶向cav3的97位点突变密码子。

44、在一些优选的方案中，所述第一探针如seq id no：7所示。

45、在一些优选的方案中，所述第二探针如seq id no：8所示。

46、在一些优选的方案中，所述第三探针如seq id no：9所示。

47、在一些优选的方案中，所述第四探针如seq id no：16所示。

48、在一些优选的方案中，所述第五探针如seq id no：17所示。

49、在一些优选的方案中，所述第六探针如seq id no：18所示。

50、在一些优选的方案中，所述第七探针如seq id no：27所示。

51、在一些优选的方案中，所述第八探针如seq id no：28所示。

52、在一些优选的方案中，所述第九探针如seq id no：29所示。

53、在一些优选的方案中，所述第十探针如seq id no：30所示。

54、在一些优选的方案中，所述引物探针混合液包括：第一引物对组和第一探针组；

55、第二引物对组和第二探针组；和/或

56、第三引物对组和第三探针组。

57、在一些优选的方案中，所述第一探针具有第一荧光标记；

58、所述第二探针、所述第四探针、所述第九探针具有第二荧光标记；

59、所述第三探针、所述第六探针、所述第八探针具有第三荧光标记；

60、所述第五探针、所述第七探针、所述第十探针具有第四荧光标记；

61、且，所述第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光和所述第四荧光标记标记互不相同。

62、在一些优选的方案中，所述第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光和所述第四荧光分别选自fam、cy5、texas red和vic中任一种。

63、在一些优选的方案中，所述第一探针核苷酸序列的5’端标记有fam，且3’端标记有bhq1。

64、在一些优选的方案中，所述第二探针、所述第四探针、所述第九探针的核苷酸序列的5’端标记有cy5，且3’端标记有bhq2。

65、在一些优选的方案中，所述第三探针、所述第六探针、所述第八探针的核苷酸序列的5’端标记有texas red，且3’端标记有bhq2。

66、在一些优选的方案中，所述第五探针、所述第七探针、所述第十探针的核苷酸序列的5’端标记有vic，且3’端标记有bhq1。

67、本发明的第三方面，提供了一种用于检测人类kcnq1、kcnh2、scn5a、kcnj2和/或cav3基因的试剂盒，所述试剂盒包括第一容器、第二容器和/或第三容器；

68、其中，所述第一容器包括第一引物对组和第一探针组；

69、所述第二容器包括第二引物对组和第二探针组；

70、所述第三容器包括第三引物对组和第三探针组。

71、在一些优选的方案中，所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器包括pcr反应酶系；优选地，所述pcr反应酶系包括逆转录酶、热启动taq抗体酶或其稀释液。

72、在一些优选的方案中，所述pcr反应酶系还包括udg酶。

73、在一些优选的方案中，所述试剂盒还包括阴性质控品。

74、在一些优选的方案中，所述试剂盒还包括阳性质控品。

75、在一些优选的方案中，所述试剂盒包括本发明第二方面所述的引物探针混合液、dna buffer、热启动taq抗体酶和纯化水。

76、在一些优选的方案中，所述dna buffer包括(nh4)2so4、tris-hcl、mgcl2和tween-20。

77、在一些优选的方案中，所述阳性质控品包括第一阳性质控品、第二阳性质控品和第三阳性质控品；

78、其中，所述第一阳性质控品包括kcnq1 760g和kcnq1 760a、kcnq1 805g和kcnq1805a、kcnq1 1022c和kcnq1 1022a、kcnh2 1681g和kcnh2 1681a的杂合突变型核酸；

79、所述第二阳性质控品包括kcnh2 1838c和kcnh2 1838t、scn5a 1100g和scn5a1100a、kcnj2 199c和kcnj2 199t的杂合突变型核酸；

80、所述第三阳性质控品包括kcnh2 1655t和kcnh2 1655c、scn5a 5350g和scn5a5350a、cav3 290t和cav3 290g的杂合突变型核酸。

81、在一些优选的方案中，所述阴性质控品为纯化水。

82、本发明的第四方面，提供了一种检测人类kcnq1、kcnh2、scn5a、kcnj2和/或cav3基因的方法，所述方法包括步骤：

83、(1)提供待检测样本，所述样本中含有人全血核酸；

84、(2)制备扩增反应体系，进行扩增反应；

85、(3)对步骤(2)扩增反应所得产物进行熔解曲线分析；

86、其中，所述扩增反应体系包括步骤(1)提供的待检测样本和本发明第一方面所述的引物对组。

87、在一些优选的方案中，所述扩增反应体系包括步骤(1)提供的待检测样本和本发明第二方面所述的引物探针混合液。

88、在一些优选的方案中，所述样本品为体液样品或组织样本，和更优选所述样本选自活组织检查样本、细跑培养物、经自化处理的样本(如石蜡包理样本)、全血、血浆、血洁、唾液、搞髓；在、汗液、痰、肺泡灌洗液、尿液、粪便、分泌液、乳汁和腹膜液；例如人全血。

89、在一些优选的方案中，所述方法为非诊断目的。例如，用于对环境样本进行检测。

90、本发明相对于现有技术而言，至少具有下述优点：

91、(1)本发明提供的用于检测人全血基因组dna中致lqts的高频突变基因kcnq1、kcnh2、scn5a、kcnj2、cav3的方法，可以在体外快速定性联合检测致lqts的多个高频突变基因(高频突变基因的高频突变位点包括kcnq1的3个突变密码子254、269、341，kcnh2的4个突变密码子552、561、613、614，scn5a的2个突变密码子367、1784，kcnj2的突变密码子67，cav3的突变密码子97)，简化了操作过程，与传统方法相比，能够将lqts高频突变基因检测时间缩短至3小时。

92、(2)本发明提供的用于检测人全血基因组dna中致lqts的高频突变基因kcnq1、kcnh2、scn5a、kcnj2、cav3的试剂盒通过临床验证，灵敏度高、重现性和准确度均较好。

93、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。