丁酸梭菌高密度发酵的方法与流程

本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种丁酸梭菌高密度发酵的方法。

背景技术：

1、丁酸梭菌是一种严格厌氧菌，主要存在于奶酪、天然酸奶、健康动物肠道、动物粪便及土壤中，其代谢产物主要有丁酸、乙酸、乳酸等，细胞在pyg肉汤中为直杆状，两端钝圆，运动且周生鞭毛，0.5-1.7μm*2.4-7.6μm。单个、成对或短链状，偶见丝状菌体，芽孢椭圆形，中生或次端生，一般不会使细胞膨大。丁酸梭菌为内生芽孢状态存在，具有较强的耐受低胃酸、耐胆汁等特性，对外界环境抵抗力强，经高温加工制粒等处理后仍能保持较高的活性和丁酸梭菌数量。

2、丁酸梭菌的高密度发酵工艺多采用一级种子、二级种子培养、发酵培养这种单批次间歇式发酵生产工艺，作为一种严格厌氧菌，每批次发酵时均需创造严格的厌氧发酵条件，一般需通入氮气或加入液体石蜡来隔绝空气，而这又对氮气的纯度、洁净度或发酵液中石蜡的后处理提出更高的要求。

3、且种子虽经过二级扩培，体积增多，但整体发酵水平不高，单位体积内丁酸梭菌数量较低，接入发酵罐后起始丁酸梭菌数量低，导致发酵延滞期增加，发酵周期变长，菌体的生长容易受到代谢产物的反馈抑制，导致其菌体发酵密度不高。

4、cn108130296a中丁酸梭菌的发酵方法为多级连续发酵，高密度多级连续发酵的方法能够控制各级发酵罐中菌体的生长速率与菌体密度，最大限度的降低了代谢产物的累积，促进丁酸梭菌在发酵后期的进一步生长，得到的丁酸梭菌菌液菌体浓度达到1011cfu/ml以上，该方法虽然提高了菌体浓度，但操作上比较繁琐，增大了染菌的机率，且随着发酵时间的延长，退化或变异菌体会大量消耗培养基中的有效成分，培养基有效利用率低且后期利用不充分，发酵终点芽孢率较难稳定。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了同步解决丁酸梭菌发酵过程中严格控制厌氧条件和发酵周期长，发酵密度不高和连续酵过程中因菌体退化或变异而大量消耗培养基中的有效成分，导致培养基有效利用率低且后期利用不充分，发酵终点芽孢率较难稳定的问题，提供一种丁酸梭菌高密度发酵的方法，该方法通过回用芽孢体实现丁酸梭菌发酵，通过一次或多次连续回用，均能稳定实现发酵终点丁酸梭菌数量高、芽孢率高、培养基利用率高的目标，且发酵周期明显缩短，有助于工业化生产中产能的提升和生产成本的降低。

2、为了实现上述目的，本发明提供一种丁酸梭菌高密度发酵的方法，该方法包括对丁酸梭菌发酵液进行营养体杀灭处理，然后将处理后的发酵液作为种子液进行丁酸梭菌的发酵；

3、其中，所述丁酸梭菌发酵液中的芽孢率为85％以上。

4、优选地，所述丁酸梭菌发酵液中的活菌数为1*109cfu/ml以上。

5、优选地，所述营养体杀灭处理的方式包括将丁酸梭菌发酵液在75-105℃下处理5-20min。

6、优选地，该方法还包括：将发酵得到的物料进行至少一次回用，发酵生产丁酸梭菌；

7、所述回用的方式为对发酵得到的物料进行营养体杀灭处理，然后将处理后的物料作为种子液进行丁酸梭菌的发酵。

8、本发明的技术方案有以下有益效果：

9、1、将芽孢体回用为发酵培养种子，去除了分批培养过程要求极为严格的一级、二级种子培养，优化了发酵生产工艺，简化了操作步骤，减少发酵染菌机率。

10、2、回用芽孢体后的发酵培养可以无需创造严格厌氧条件，如无需氮气保压或液体石蜡液封。主要原因为回用芽孢体发酵时丁酸梭菌数量较高(优选为109cfu/ml以上)，进入发酵罐后能快速呈数量级增加进行生长代谢并产生气体，使发酵罐内持续维持正压环境，满足绝对厌氧发酵条件。

11、3、采用本发明所述的方法进行发酵产丁酸梭菌时，发酵结束时发酵液中活菌数的浓度与传统发酵过程的活菌数能够维持相当的水平，且发酵过程中几乎没有延滞期，缩短了发酵周期(能够缩短10-43％)，而且提高了发酵设备利用率，为工业化生产过程中产能的提升奠定了基础。

12、4、同传统连续发酵相比，本发明通过对回用发酵液进行加热操作，将发酵培养过程中退化或变异的菌体及时进行杀灭，解决了长发酵周期内退化或变异菌体大量消耗培养基有效成分导致的发酵水平低下的问题，实现发酵培养基利用率高、终点丁酸梭菌数量高、芽孢率高的目标，进一步降低生产成本。

技术特征：

1.一种丁酸梭菌高密度发酵的方法，其特征在于，该方法包括对丁酸梭菌发酵液进行营养体杀灭处理，然后将处理后的发酵液作为种子液进行丁酸梭菌的发酵；

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述丁酸梭菌发酵液中的芽孢率为90％以上。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述丁酸梭菌发酵液中的活菌数为1*109cfu/ml以上。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述营养体杀灭处理的方式包括将丁酸梭菌发酵液在75-105℃下处理5-20min。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述处理后的发酵液中芽孢率达到95％以上。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述种子液的接种量为0.5-2体积％。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述发酵的方式包括：使用碳酸钠或氢氧化钠控制发酵过程中的ph为6-7.5，当ph开始回升时即为发酵终点。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述发酵的条件包括：温度为35-40℃，时间为10-20h，厌氧发酵。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法还包括：将发酵得到的物料进行至少一次回用，发酵生产丁酸梭菌；

10.根据权利要求1-9中任意一项所述的方法，其中，以重量计，用于发酵的发酵培养基包含：葡萄糖3-4.5％，可溶淀粉0-1.5％，酵母浸粉1-1.5％，蛋白胨1.5-2％，硫酸锰0-0.2‰，硫酸镁0-0.2‰，醋酸钠0-0.5％，磷酸氢二钾0-0.3％，磷酸二氢钾0-0.2％，碳酸钙0.2-0.8％，吐温80 0-1‰。

技术总结本发明涉及微生物发酵领域，公开了丁酸梭菌高密度发酵的方法，该方法包括对丁酸梭菌发酵液进行营养体杀灭处理，然后将处理后的发酵液作为种子液进行丁酸梭菌的发酵；其中，所述丁酸梭菌发酵液中的芽孢率为85％以上。相比于常规的发酵工艺，本发明所述的方法简化了发酵工艺，减少发酵染菌几率，且无需创造严格厌氧条件，还能够缩短发酵时间，提高了生产效率。技术研发人员：周勇,邴狄祥,卢宗梅,朱光耀,吴信梅,刘利利受保护的技术使用者：中粮生物科技股份有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/18