一种鸟苷酰-(5′→3′)-2′-氧甲基-5′-腺苷酸的制备方法与流程

本发明涉及化学原料药的制备，具体地，涉及一种无定型鸟苷酰-(5′→3′)-2′-氧甲基-5′-腺苷酸的制备方法。

背景技术：

1、mrna(信使核糖核酸)是由dna的一条链作为模板转录而来、携带遗传信息能指导蛋白质合成的一类单链rna。mrna理论上可以表达任何蛋白质，被称为“万能钥匙”，可以探索治疗几乎所有基于蛋白质的疾病。与传统药物相比，mrna可以快速设计、高效制造、安全递送并在细胞内有效转化为蛋白质。在新冠疫苗研发中，mrna技术首次得到产业化验证，推动了在其他治疗领域的快速商业化发展，如今mrna技术在肿瘤疫苗、基因编辑、car-t细胞治疗、蛋白替代疗法及其他传染病预防性疫苗领域都已逐步成熟。

2、mrna制备技术的开发难点和关键技术点在于合成修饰。真核细胞mrna的5′端具有帽子结构，即m7g结构通过5′-5′三磷酸桥连接rna链的第一个核苷酸。帽子结构有很多重要的生物学功能，譬如保护mrna，防止5′外切核酸酶的降解，除此之外，帽子结构对于mrna的稳定性，以及真核细胞翻译起始因子4e(eif4e)对于mrna的有效识别，都是非常重要的，所以5′cap修饰对于mrna的特性改善至关重要。

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4、鸟苷酰-(5′→3′)-2′-氧甲基-5′-腺苷酸(2′-o-methyl-5′-o-phosphonoadenylyl-(3′→5′)-guanosine,pampg)是制备加帽核苷酸的关键原料。目前pampg的制备大多采用合成与柱层析结合的方式，该方法产能受限，不利于工业化生产；而且产物都为pampg三乙胺盐形式，pampg三乙胺盐中游离pampg有效含量约70～75％，这意味着以pampg三乙胺盐为原料制备加帽核苷酸的反应原子经济性低、工艺经济性差。针对现有制备工艺中存在的技术障碍，本发明寻求一种经济高效的pampg工业化制备方法。

技术实现思路

1、鸟苷酰-(5′→3′)-2′-氧甲基-5′-腺苷酸作为加帽核苷酸的重要原料，本发明为了克服现有制备方法的不足，提供了一种鸟苷酰-(5′→3′)-2′-氧甲基-5′-腺苷酸的制备方法，该方法可生产公斤级pampg，通过析晶对产品进行纯化，不仅节约了大量溶媒的使用和废水的排放，而且得到的是无定型pampg，相较于目前常规使用的pampg三乙胺盐，在进一步制备相应的加帽核苷酸时，更具原子经济性和工艺经济性。

2、本发明提供的鸟苷酰-(5′→3′)-2′-氧甲基-5′-腺苷酸的制备方法，以x5-e为起始物料，经水解反应和析晶反应，得到鸟苷酰-(5′→3′)-2′-氧甲基-5′-腺苷酸bb-3，反应式如下式所示：

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4、优选技术方案中，水解反应为甲醇溶解x5-e，加入氨水进行反应。甲醇和x5-e的体积/质量比为10～25:1，优选为15～20:1；氨水和x5-e的体积/质量比为10～25:1，优选为15～20:1；反应温度为20～50℃，优选为30～40℃；反应时间为30～60小时，优选为44～55小时。

5、优选技术方案中，析晶反应使用二氯甲烷对水解反应液进行萃取，弃有机相，在水相中加入甲醇，调节溶液ph至1.0～8.0，降温搅拌，析晶过滤，滤饼真空干燥，得到鸟苷酰-(5′→3′)-2′-氧甲基-5′-腺苷酸粗品。

6、优选技术方案中，水解反应液35～55℃减压浓缩至x5-e的5倍体积/质量比，之后二氯甲烷萃取3次及以上，二氯甲烷和x5-e的体积/质量比为1～10:1，优选为3～5:1；

7、优选技术方案中，水相中加入的甲醇和x5-e的体积/质量比为10～40:1，优选为20～30:1；使用1～3mol/l稀盐酸调节溶液ph，ph优选调节至1.5～4.5。

8、优选技术方案中，析晶时降温至-5～15℃，优选为0～10℃；搅拌0.5～1.5小时；40～60℃真空干燥，时间为16～24小时，得到鸟苷酰-(5′→3′)-2′-氧甲基-5′-腺苷酸粗品。

9、优选技术方案中，得到鸟苷酰-(5′→3′)-2′-氧甲基-5′-腺苷酸粗品后，还包含后续的精制过程。所述精制过程为鸟苷酰-(5′→3′)-2′-氧甲基-5′-腺苷酸粗品在有机溶剂或/和水体系中，搅拌后过滤或者升温至回流，再缓慢降温至0～10℃，搅拌后过滤，滤饼置于35～45℃真空干燥12～24小时，得到精制鸟苷酰-(5′→3′)-2′-氧甲基-5′-腺苷酸。

10、优选技术方案中，有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、四氢呋喃的一种，优选甲醇、乙醇；有机溶剂与粗品的体积/质量比为3～10:1，优选5～7:1，水与粗品的体积/质量比为0～3:1，优选0～1.5:1。

11、本发明制备所得鸟苷酰-(5′→3′)-2′-氧甲基-5′-腺苷酸，可用于制备带帽核苷酸。

12、该制备方法的优势在于：

13、1、通过析晶替代柱层析对产品进行纯化，实现pampg的公斤级生产；

14、2、避免使用柱层析，节约了大量溶媒的使用和废水的排放，简化了生产操作，对生产设备要求变低，使整体工艺成本降低，收率增加；

15、3、析晶方法得到的是一种晶型较为稳定的无定型pampg游离态，经高温高湿放置检测，该无定形pampg稳定性高，且溶解性好，易于进行后续制备。

16、4、相比于常规提供的pampg三乙胺盐(扣除三乙胺的占比，一般pampg含量在该盐型化合物中占比70～75％左右)，本发明提供的无定形pampg(几乎没有其他阴离子与其成盐，pampg含量占比95％左右)对于后续相应加帽核苷酸的制备，更具原子经济性和工艺经济性。

技术特征：

1.一种鸟苷酰-(5′→3′)-2′-氧甲基-5′-腺苷酸的制备方法，其特征在于：以x5-e为起始物料，经水解反应和析晶反应，得到鸟苷酰-(5′→3′)-2′-氧甲基-5′-腺苷酸bb-3，

2.权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述水解反应为甲醇溶解x5-e，加入氨水进行反应。

3.权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述甲醇和x5-e的体积/质量比为10～25:1，优选为15～20:1；氨水和x5-e的体积/质量比为10～25:1，优选为15～20:1；反应温度为20～50℃，优选为30～40℃；反应时间为30～60小时，优选为44～55小时。

4.权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述析晶反应使用二氯甲烷对水解反应液进行萃取，弃有机相，在水相中加入甲醇，调节溶液ph至1.0～8.0，降温搅拌，析晶过滤，滤饼真空干燥，得到鸟苷酰-(5′→3′)-2′-氧甲基-5′-腺苷酸粗品。

5.权利要求4所述的制备方法，其特征在于：水解反应液35～55℃减压浓缩至x5-e的5倍体积/质量比，之后二氯甲烷萃取3次及以上，二氯甲烷和x5-e的体积/质量比为1～10:1，优选为3～5:1。

6.权利要求4所述的制备方法，其特征在于：水相中加入的甲醇和x5-e的体积/质量比为10～40:1，优选为20～30:1；使用1～3mol/l稀盐酸调节溶液ph，ph优选调节至1.5～4.5。

7.权利要求4所述的制备方法，其特征在于：析晶时降温至-5～15℃，优选为0～10℃；搅拌0.5～1.5小时；40～60℃真空干燥，时间为16～24小时，得鸟苷酰-(5′→3′)-2′-氧甲基-5′-腺苷酸粗品。

8.权利要求1-7任一所述的制备方法，其特征在于：还包含后续有机溶剂或/和水体系的精制过程。

9.权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述精制过程为鸟苷酰-(5′→3′)-2′-氧甲基-5′-腺苷酸粗品在有机溶剂或/和水体系中，搅拌后过滤或者升温至回流，再缓慢降温至0～10℃，搅拌后过滤，滤饼置于35～45℃真空干燥12～24小时，得到精制鸟苷酰-(5′→3′)-2′-氧甲基-5′-腺苷酸。

10.权利要求8-9任一所述的制备方法，其特征在于：所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、四氢呋喃的一种，优选甲醇、乙醇；有机溶剂与粗品的体积/质量比为3～10:1，优选5～7:1，水与粗品的体积/质量比为0～3:1，优选0～1.5:1。

11.权利要求1-10任一所述方法制备所得鸟苷酰-(5′→3′)-2′-氧甲基-5′-腺苷酸，在用于制备带帽核苷酸中的用途。

技术总结本发明提供一种鸟苷酰‑(5′→3′)‑2′‑氧甲基‑5′‑腺苷酸(pAmpG)的制备方法，操作简便，经济高效，实现了加帽核苷酸主要原料的公斤级生产。该制备方法所得无定形pAmpG稳定性高且溶解性好，pAmpG含量占比高，对于后续合成相应的加帽核苷酸，具有良好的原子经济性和工艺经济性。技术研发人员：方丽,郑福贵,蒋东栋,陈帅,蒋晓俊,吴尧受保护的技术使用者：杭州中美华东制药有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/18