clp基因缺失株的构建方法及其作为弱毒疫苗候选株的应用

本发明属于生物基因工程，尤其涉及clp基因缺失株的构建方法及其作为弱毒疫苗候选株的应用。

背景技术：

1、猪链球菌2型(ss2)被认为是一种人兽共患病病原，尽管人类受其感染的流行病学在很大程度上仍未确定，但基本上所有的病例都与处理、食用未加工的猪产品或者与猪密切接触有关，当然，也可以感染一般人群。近年来，包括越南、中国、美国、加拿大和欧洲地区国家报道猪链球菌感染人类事件屡见不鲜，而几乎所有报告的人类猪链球菌感染均由血清2型菌株引起。与其他血源性的病原菌一样，ss2感染后，如果败血症或中毒性休克样综合征没有使宿主死亡，那么ss2也可能会突破bbb，导致脑膜炎的发生。化脓性或非化脓性脑膜炎为人类感染最严重的临床特征，主要表现为发烧、头痛、颈部僵硬、口吐白沫和听力损失，具有脑膜炎症状病人的愈后转归通常是永久性听力损失或者前庭功能障碍。然而，该疾病发展为脑膜炎的机制目前尚不清楚，严重限制了猪链球菌脑膜炎新的防治策略的研发。

2、在脑膜炎发生发展的过程中，病原菌穿过bbb的能力至关重要。近些年，对于猪链球菌毒力因子的研究，大多数都是用血清2型菌株进行的，在ss2感染诱导宿主发病的每个步骤中，不同的猪链球菌毒力因子都发挥着重要作用。其中，一些细胞相关或分泌的毒力因子，包括溶血素、烯醇化酶、胞壁苷酶释放蛋白、h因子结合表面蛋白和腺苷合酶等，对ss2破坏bbb结构和功能，进而诱导脑膜炎的发病机理十分关键，但目前相关研究并不充分。

3、ss2在感染宿主的过程中，通过表达多种毒力蛋白，协同构成完全毒力。本实验室前期通过猪链球菌全基因组噬菌体随机展示文库与猪体外bbb的相互作用实验证实ss2的胶原酶样蛋白酶(collagenase-like protease，clp)是与bbb相关的毒力因子之一。wilson等人发现，ss2胶原酶样蛋白酶的基因转座突变体在猪和小鼠模型上都有一定的减毒效果。ss2 clp蛋白作为u32肽酶家族假定的胶原酶，或可成为一种潜在的ss2毒力蛋白，在ss2突破血脑屏障诱发脑膜炎的过程发挥重要的作用。但其具体作用和致病机制亟需进一步的研究论证。

技术实现思路

1、本发明实施例的目的在于提供clp基因缺失株的构建方法及其作为弱毒疫苗候选株的应用，旨在解决上述背景技术中提出的问题。

2、本发明实施例是这样实现的，clp基因缺失株的构建方法，包括以下步骤：

3、步骤1、重组质粒pset4s-δclp的构建：

4、以猪链球菌2型菌株为模板，采用引物对p1/p2、p3/p4分别扩增clp基因上、下游同源臂的1000bp目的片段；

5、引物p1的序列为：cccaagcttataggggagaaaatctggggaaac

6、引物p2的序列为：

7、aaataaattctgctataaatattaaaggataattatatcaaaaagaga

8、引物p3的序列为：

9、tctctttttgatataattatcctttaatatttatagcagaatttattt

10、引物p4的序列为；ccggaattctacacatgtccactgcagacatag

11、之后将扩增的片段以p1/p4为引物对进行重叠延伸pcr，获得上、下游同源臂的连接产物；1％琼脂糖凝胶电泳后经胶回收试剂盒回收；用限制性内切酶hindⅲ和ecorⅰ同时双酶切胶回收产物与温敏性自杀质粒pset4s，并用dna产物纯化试剂盒回收核酸，t4 dna连接酶连接后转化至大肠杆菌dh5α中，用100μg/ml的壮观霉素抗性筛选后，挑取疑似菌落进行扩大培养，用试剂盒提取质粒后，对所提取的质粒进行pcr、双酶切及测序鉴定，将鉴定为阳性的重组质粒命名为pset4s-δclp；

12、步骤2、δclp缺失株的筛选与鉴定：

13、挑取电转后的单菌落，接种到壮观霉素抗性的bhi液体培养基中，28℃，180r/min振荡培养18h后，转接入含壮观霉素抗性的bhi液体培养基中，37℃，180r/min过夜培养；菌液划线接种于含壮观霉素抗性的bhi固体平板，37℃温箱培养过夜；挑取单菌落，分别接种于有或无壮观霉素抗性的bhi平板，37℃温箱培养后筛选到耐壮观霉素抗性的菌落；利用引物对x/y进行pcr鉴定，其中，引物x的序列为：tgcttgataggtttgaaaattagcc；引物y的序列为：ttttccatgtggaaacctagtgc；

14、若扩增得到500bp和1430bp大小的两条带，证明单交换突变株出现；连续传代培养6-8代后，菌液划线接种于含壮观霉素抗性的bhi固体平板上，37℃过夜培养；挑取菌落，利用clp基因内部引物e/f进行鉴定，最终获取双交换突变株，即δclp缺失株(猪链球菌δclp，streptococcus suisδclp)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2024112，保藏日期：2024年1月15日。

15、进一步的技术方案，在所述步骤1中，50μl的pcr反应体系：2×prime star premix25μl，10μmol/l的上、下游引物各1μl，模板1μl，ddh2o 22μl。

16、pcr反应条件：98℃5min；98℃15s，55℃15s，72℃2min，30个循环；72℃10min。

17、本发明实施例的另一目的在于，clp基因缺失株作为弱毒疫苗候选株的应用，基于上述clp基因缺失株的构建方法所构建的δclp缺失株，将所述δclp缺失株应用于预防猪链球菌2型感染中。

18、进一步的技术方案，将所述δclp缺失株作为猪抗链球菌2型感染的备选活菌疫苗。

19、本发明实施例提供的clp基因缺失株的构建方法及其作为弱毒疫苗候选株的应用，明确了猪链球菌2型的clp基因敲除菌株δclp具有非常低的毒力。以该突变株活菌，大剂量免疫小鼠，对小鼠不具有感染损伤。在铝胶佐剂的辅助下，小鼠体内可产生高水平的抗体，并能够成功建立一定的免疫保护。与普通活菌疫苗相比，该突变菌株免疫且有效。在正常的免疫程序后，建立的免疫保护能够有效地帮助小鼠抵抗猪链球菌2型的感染，降低小鼠的死亡率和体内细菌的定植。另外，该clp基因敲除菌株的制作方法简单，制作周期短，培养条件无特殊要求，作为疫苗免疫时不需其他复杂的处理，洗菌后与佐剂混合即可使用。该敲除菌株可作为猪抗链球菌2型感染的备选活菌疫苗。

技术特征：

1.clp基因缺失株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的clp基因缺失株的构建方法，其特征在于，在所述步骤1中，50μl的pcr反应体系：2×prime starpremix 25μl，10μmol/l的上、下游引物各1μl，模板1μl，ddh2o 22μl；

3.clp基因缺失株作为弱毒疫苗候选株的应用，基于上述权利要求1和2任一项所述的clp基因缺失株的构建方法所构建的δclp缺失株，其特征在于，将所述δclp缺失株应用于预防猪链球菌2型感染中。

4.根据权利要求3所述的clp基因缺失株作为弱毒疫苗候选株的应用，其特征在于，将所述δclp缺失株作为猪抗链球菌2型感染的备选活菌疫苗。

技术总结本发明适用于生物基因工程技术领域，提供了clp基因缺失株的构建方法及其作为弱毒疫苗候选株的应用，所述方法包括以下步骤：步骤1、重组质粒pSET4S‑Δclp的构建：步骤2、Δclp缺失株的筛选与鉴定(所获取的Δclp缺失株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2024112)；并将所制备的Δclp缺失株应用于预防猪链球菌2型感染中。本发明明确了猪链球菌2型的clp基因敲除菌株Δclp具有非常低的毒力，该clp基因敲除菌株的制作方法简单，制作周期短，培养条件无特殊要求，作为疫苗免疫时不需其他复杂的处理，洗菌后与佐剂混合即可使用。该敲除菌株可作为猪抗链球菌2型感染的备选活菌疫苗。技术研发人员：雷连成,梅纪坤,李娜,李丰阳,姜轩,吴桐,武增帅受保护的技术使用者：吉林大学技术研发日：技术公布日：2024/6/13