一种大熊猫源巴贝斯虫检测引物组合、试剂盒和用途的制作方法

本发明属于微生物学，具体涉及一种基于taqman探针的大熊猫源巴贝斯虫检测引物组合、试剂盒和用途。

背景技术：

1、巴贝斯虫（ babesia）属于顶复门、孢子虫纲、梨形虫亚纲、梨形虫目、巴贝斯虫科、巴贝斯虫属。感染巴贝斯虫引起的疾病叫做巴贝斯虫病，主要临床症状包括：高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿等。巴贝斯虫可感染牛、羊等家畜造成畜牧业的重大损失，大熊猫、麋鹿、小熊猫等野生动物和人也可感染。巴贝斯虫病最常见的检测方法包括血液涂片显微镜检查法、pcr检测法等，随着技术的发展套式pcr、荧光定量pcr等检测方法也逐步应用于该病原的检测。然而，巴贝斯虫种类繁多，目前已鉴定的巴贝斯虫包括犬巴贝斯虫、吉氏巴贝斯虫、牛巴贝斯虫等一百多种。

2、大熊猫巴贝斯虫感染于2021年首次报道，被认为是一种新的巴贝斯虫，用血液涂片显微镜检查法检出率低，目前已应用于大熊猫巴贝斯虫检测的分子检测方法是套式pcr检测法，然而该检测方法虽有高灵敏性的优点，但检测时不仅需要采用两轮pcr检测，耗时长且容易出现污染干扰，还需要经过测序才能对结果进行验证。也有以18s rrna作为靶基因来鉴定检测的方案，但由于该基因过度保守不能在不同种巴贝斯虫间进行有效区分，其仅能鉴定到巴贝斯虫，但不能确定具体虫种，特异性不强，不利于大熊猫巴贝斯虫的流行病学研究。

3、此外，由于巴贝斯虫有着较强的种属特异性，用于牛、羊、犬等其他物种感染的巴贝斯虫的检测方法包括染料法和探针法等不能直接用于大熊猫巴贝斯虫的检测，目前缺乏大熊猫巴贝斯虫种间特异性检测，因而亟需建立一种针对大熊猫巴贝斯虫的更为特异、快速、干扰少的检测方法。

技术实现思路

1、针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种基于taqman探针的大熊猫源巴贝斯虫检测引物组合、试剂盒和用途，本发明针对大熊猫源巴贝斯虫的cob基因的特异性区域，设计2条特异性引物、1条taqman探针和特异性反应程序和条件，提供了一种针对大熊猫源巴贝斯虫的taqman探针荧光定量pcr检测方法，解决了缺乏针对大熊猫巴贝斯虫特异的分子检测方法，实现仅针对大熊猫巴贝斯虫特异性好、准确性好、灵敏性高、检测效率高的早期诊断方法。

2、为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

3、一种基于taqman探针的大熊猫源巴贝斯虫检测引物组合，包括特异性引物序列和taqman探针，特异性引物序列为：

4、bd-q-f：5’-ccttgaaacaaaggaatca-3’；（seq id no.1）

5、bd-q-r：5’-ctggaatagattcatggtttg-3’；（seq id no.2）

6、taqman探针为：

7、bd-q-prob：5’-taagtcaactgaacaccaagcaacac-3’。（seq id no.3）

8、进一步地，taqman探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有淬灭基团。

9、进一步地，荧光报告基团为fam、tet、hex、5-tamra、rox、texas red-x或cy3等；所述淬灭基团为bhq1、bhq2或bhq3等。

10、进一步地，荧光报告基团为fam，淬灭基团为bhq1。

11、一种对大熊猫源巴贝斯虫进行检测的试剂盒，包括上述的引物组合。

12、进一步地，上述试剂盒还包括pcr反应预混液、阴性对照和含有如seq id no.4所示序列的阳性对照。

13、进一步地，pcr反应预混液包括taq酶、dtnp、mg2+离子、缓冲液等成分。

14、进一步地，本发明中基因序列为大熊猫巴贝斯虫cob基因序列，长度为555 bp。该阳性对照是通过将扩增产物克隆至puc57转化 e. colitop10感受态细胞，经酶切鉴定及测序后获得的阳性重组质粒dna，此质粒dna是本发明试剂盒中所使用的阳性对照，该阳性对照所含有的特异性序列如下所示：

15、tccatagcaaattaatccagctatcttacttggaaataactttaaagttgcatagaaagttagcagataccattcaggtactatatgcaaaggtgtttgaagaggatttgaaacaatagaattatcacaatctccttgaaacaaaggaatcactccataagtcaactgaacaccaagcaacacaaataacatggctaacattcttatgtcactaaataaaattacaggataaaaccttgttacaaaccatgaatctattccagacaatggatttgtactagaagatctatgtagataatatatatgaataataataacaaataataaaacaaaaggtaacacaaaatgtaatatataaaacctctgtaaagtagctacagttacaccataaccaccaagaagaagtattacaaaatctgggatccaataaaataaattagttataactgtagctccccaataactcatttgaccatttggaagaacataacccaaaaaagctatagccatacttaatataaataaaatcattccagaatacctgaacccaaggta（seq id no.4）。

16、上述引物组合或试剂盒在制备对大熊猫源巴贝斯虫进行荧光定量pcr检测的制剂中的用途。

17、进一步地，进行taqman探针荧光定量pcr检测时，扩增体系如下：待测dna模板2 μl，bd-q-f和bd-q-r引物各加入0.4 μl，bd-q-prob 0.2 μl，2× hieff unicon®universaltaqman multiplex qpcr master mix 10 μl，最后以 ddh2o补足20 μl。

18、进一步地，进行taqman探针荧光定量pcr检测时，扩增程序如下：94 ℃预变性3min，94 ℃变性10 s，55.6 ℃退火30 s，共40个循环，然后在每个循环的退火延伸阶段收集荧光信号。

19、本发明的有益效果：

20、1、根据本发明构建的技术方案，在对大熊猫源巴贝斯虫检测时，仅需进行一轮pcr，且时间仅需要1 h，大大缩短检测时间，比普通pcr检测提高了至少100倍的灵敏度，实现了对微量大熊猫血液进行检测，也能获得高检测率的优势，解决了大熊猫血液珍贵，仅用微量血液也能获得优越检测效果，具有显著的灵敏性和实用性，适用于大熊猫血液巴贝斯虫的检测。

21、此外，与血液涂片显微镜镜检法相比，显著提高大熊猫源巴贝斯虫检测灵敏度和准确性，降低漏检率；与血清学检测相比，克服了缺乏大熊猫特异性抗体，显著提高准确性并能即时反映是否携带虫体的情况。

22、2、巴贝斯虫在宿主体内可长期存在，当其大量增殖时才会导致宿主出现明显的临床症状。本发明采用taqman探针荧光定量pcr检测方法对大熊猫巴贝斯虫进行检测，探针两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，pcr仪检测不到荧光信号；当pcr扩增时，taq酶的5'~3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条dna链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与pcr产物形成完全同步，通过荧光信号的变化即可对样本进行定量，实现了对大熊猫血液中巴贝斯虫含量的监测，有助于大熊猫巴贝斯虫的防治。

23、此外，本发明中采用的taqman探针，只有产物为目的片段时，报告荧光基团和淬灭荧光基团才会分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，实现了荧光信号的累积与pcr产物形成完全同步，因而不需要进行进一步的测序即可对结果进行判读，进一步提高大熊猫巴贝斯虫检测的特异性、准确性、检测效率。

24、3、本发明使用大熊猫巴贝斯虫cob基因作为检测靶基因，该基因属于巴贝斯虫线粒体上的一段保守基因，但不同种巴贝斯虫间存在保守性，而目前常用于巴贝斯虫检测的靶基因为18s rrna基因，由于该基因过度保守不能在不同种巴贝斯虫间进行有效区分。

25、4、本发明提供了一种大熊猫源巴贝斯虫cob阳性质粒及构建方法，该阳性质粒作为阳性对照或阳性质控品，可实现在检测部门和各个饲养单位对大熊猫巴贝斯虫的pcr检测工作。

26、5、目前报道的巴贝斯虫有一百多种，不同巴贝斯虫的cob基因存在差异，而同种巴贝斯虫的cob基因具有高度的保守性，本发明中的检测方法对ncbi上能够检索到的巴贝斯虫cob基因也合成了质粒进行检测结果不会检测出其他巴贝斯虫的cob片段，证明了本检测方法的特异性。

27、6、由于巴贝斯虫的种属特异性强，大熊猫巴贝斯虫的虫种鉴定对大熊猫巴贝斯虫的流行病学研究极为重要，本研究通过大熊猫巴贝斯虫的保守基因进行检测，能够直接鉴定为大熊猫巴贝斯虫，实现巴贝斯虫种间鉴定，从而排除犬巴贝斯虫、吉氏巴贝斯虫等其他巴贝斯虫，对大熊猫巴贝斯虫的流行病学研究具有重要的意义。

28、7、本发明通过taqman探针荧光定量pcr检测方法对大熊猫血液样本提取的dna进行扩增，pcr结束通过荧光信号的结果即可对检测结果进行判读，从收到血液样本到出结果最快只需要4 h，大大提高了检测效率，缩短检测时间，为大熊猫巴贝斯虫病的治疗提供了可靠、及时的参考意义。