一种circRNA_17725过表达的工程化间充质干细胞、外泌体、其制备方法及应用

本发明属于外泌体制备，特别是涉及一种circrna_17725过表达的工程化间充质干细胞、外泌体、其制备方法及应用。

背景技术：

1、系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，sle）是一种常见的累及多器官、多系统的自身免疫性疾病，病因和发病机制尚不明确。该病临床表现具有明显异质性，可累及皮肤、浆膜、关节、肾及中枢神经系统等，以t细胞、b细胞等免疫细胞激活、功能失调、大量自身抗体产生为典型特征，与遗传、环境和雌激素等潜在相关，育龄期女性多见。目前针对sle尚无特效治疗药物，虽然抗baff单克隆抗体等生物制剂大大改善了sle患者的预后，但对于众多难治性sle患者，仍然缺乏有效治疗手段。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种circrna_17725过表达的工程化间充质干细胞、外泌体、其制备方法及应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

2、为达到上述技术目的，本发明的技术方案：

3、一种circrna_17725过表达的工程化间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：

4、s1：将人脐带间充质干细胞体外分离、传代培养，形成人脐带间充质干细胞培养基；

5、s2：将circrna_17725过表达载体溶液和polybrene溶液加入所述人脐带间充质干细胞培养基中进行病毒感染，待细胞融合度达到30%~40%，更换500μl新鲜的f12/dmem完全培养基，于37℃、5%co2的培养箱中培养，1天后进行半量换液，3天后更换无病毒液的f12/dmem完全培养基继续培养，然后用含嘌呤霉素的f12/dmem培养基进行药物筛选10天，实现间充质干细胞稳定转染，得到circrna_17725过表达的工程化间充质干细胞。

6、进一步地，步骤s1中，所述人脐带间充质干细胞体外分离、传代培养包括以下步骤：

7、s11：取无菌新鲜脐带10cm，生理盐水洗去脐带残留血液，剪成2~3cm小段，使用生理盐水再次冲洗，纵行剖开脐带，剔除1条脐静脉、2条脐动脉，剥离华通氏胶；

8、s12：用眼科剪将华通氏胶剪碎成1mm2的小组织块，取15~20块小组织块放入t-75培养瓶中，加入含有体积分数为10%fbs、100u/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素的dmem/f12完全培养基，于37℃、5%co2的培养箱中静置培养，3~4天后半量换液，5~7天后全量换液，此后每3~4天全量换液1次；

9、s13：待细胞融合度达到t-75培养瓶底面积80%~90%后，进行扩大培养，具体为：收集t-75培养瓶中的单细胞悬液于15ml无菌离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，采用f12/dmem完全培养基重悬细胞，按照1：3进行细胞传代培养。

10、进一步地，步骤s2中，所述f12/dmem培养基中嘌呤霉素的含量为5μg/ml。

11、进一步地，步骤s2中，所述polybrene溶液的浓度为5μg/ml。

12、本发明还提供一种circrna_17725过表达的工程化间充质干细胞，编码circrna_17725基因的核苷酸序列如seq id no：1所示。

13、本发明还提供circrna_17725过表达的工程化间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：

14、s1：将人脐带间充质干细胞体外分离、传代培养，形成人脐带间充质干细胞培养基；

15、s2：将circrna_17725过表达载体溶液和polybrene溶液加入所述人脐带间充质干细胞培养基中进行病毒感染，待细胞融合度达到30%~40%，更换500μl新鲜的f12/dmem完全培养基，于37℃、5%co2的培养箱中培养，1天后进行半量换液，3天后更换无病毒液的f12/dmem完全培养基继续培养，然后用含嘌呤霉素的f12/dmem培养基进行药物筛选10天，实现间充质干细胞稳定转染，得到circrna_17725过表达的工程化间充质干细胞；

16、s3：将步骤s2中得到的circrna_17725过表达的工程化间充质干细胞通过超高速离心法提纯，获得circrna_17725过表达的工程化间充质干细胞外泌体。

17、进一步地，步骤s1中，所述人脐带间充质干细胞体外分离、传代培养包括以下步骤：

18、s11：取无菌新鲜脐带10cm，生理盐水洗去脐带残留血液，剪成2~3cm小段，使用生理盐水再次冲洗，纵行剖开脐带，剔除1条脐静脉、2条脐动脉，剥离华通氏胶；

19、s12：用眼科剪将华通氏胶剪碎成1mm2的小组织块，取15~20块小组织块放入t-75培养瓶中，加入含有体积分数为10%fbs、100u/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素的dmem/f12完全培养基，于37℃、5%co2的培养箱中静置培养，3~4天后半量换液，5~7天后全量换液，此后每3~4天全量换液1次；

20、s13：待细胞融合度达到t-75培养瓶底面积80%~90%后，进行扩大培养，具体为：收集t-75培养瓶中的单细胞悬液于15ml无菌离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，采用f12/dmem完全培养基重悬细胞，按照1：3进行细胞传代培养。

21、进一步地，步骤s2中，所述f12/dmem培养基中嘌呤霉素的含量为5μg/ml。

22、进一步地，步骤s2中，所述polybrene溶液的浓度为5μg/ml。

23、进一步地，所述超高速离心法提纯的步骤如下：收集步骤s2中获得的circrna_17725过表达的工程化间充质干细胞的细胞培养上清，在4℃下高速离心三次，三次离心的离心力分别为300g、2000g、10000g，离心时间分别为10min、10min、30min，每次离心完后弃沉淀，获取上清，每次将离心后的上清进行下一次离心，将第三次离心完成后获得的上清在4℃、120000g离心力下离心70min后弃上清，获取沉淀，将获得的沉淀进行无菌pbs重悬，然后在4℃、120000g离心力下离心70min后弃上清，收集沉淀，加入100μl~300μl pbs充分溶解，获取悬液。

24、本发明还提供一种circrna_17725过表达的工程化间充质干细胞外泌体。

25、本发明还提供circrna_17725过表达的工程化间充质干细胞外泌体在制备系统性红斑狼疮治疗药物中的应用。

26、由于采用上述技术方案，本发明的有益效果：

27、本发明提供的一种circrna_17725过表达的工程化间充质干细胞，给予mrl/lpr狼疮小鼠circrna_17725过表达的工程化间充质干细胞治疗，结果显示该细胞能够上调treg、促进m2极化发挥炎症抑制和免疫调节作用，有效抑制mrl/lpr狼疮小鼠体内免疫炎症反应，改善小鼠狼疮肾炎、肺炎及脑病，对sle有明显治疗作用。

28、外泌体是间充质干细胞旁分泌调控的主要方式之一，是间充质干细胞与其它细胞进行物质转运与信息交流的重要载体。与非工程化修饰的间充质干细胞相比，circrna_17725过表达的工程化间充质干细胞作为工程化修饰的间充质干细胞，产生外泌体能力明显增强，能够通过血脑屏障等微血管结构，靶向调控脑等特定器官区域免疫，发挥治疗作用。