同时检测虫媒传染性疾病多种病原体的引物池及PCR快速检测试剂盒的制作方法

本发明属于病原体核酸检测，尤其涉及一种同时检测虫媒传染性疾病多种病原体的引物池及pcr快速检测试剂盒。

背景技术：

1、登革病毒（dengue virus，denv），主要通过蚊媒传播，属于黄病毒科黄病毒属中的一个血清型亚群，引起登革热以及发病率和死亡率很高的登革出血热和登革休克综合征。登革病毒依抗原性不同分为1、2、3、4四个血清型，同一型中不同毒株也有抗原差异。

2、寨卡病毒（zika virus，zikv）属黄病毒科，是一种通过蚊虫进行传播的虫媒病毒，具有扩散速度快的特点。宿主不明确，主要在野生灵长类动物和栖息在树上的蚊子。寨卡病毒可能导致新生儿患小头畸形和成人的急性皮疹。

3、基孔肯尼雅病毒（chikungunya virus，chikv）是引起基孔肯雅热的病原体，单股正链rna，病毒颗粒呈球形，属于披膜病毒科甲病毒属。被传染患者多表现为发热、皮疹、肌肉酸痛和关节疼痛，更有甚者可能引起脑膜炎。目前没有有效药物可以治疗。

4、黄热病毒（yellow fever virus，yfv）是引起黄热病的病原体，黄热病毒和登革和寨卡病毒等一样属于黄病毒科黄病毒属的，它同样也是单股正链rna病毒，目前已知有4种基因型而血清型只有一种。

5、西尼罗病毒（west nile virus，wnv）和上述黄热病毒等一样属于黄病毒科黄病毒属，通过蚊虫传播病毒。人类被传染后可能导致发热、脑炎等症状、极少数严重的会引起胰腺炎、肝炎、心肌炎。

6、根据who统计，虫媒传播的疾病占全部传染病的17%以上。这些疾病可能由寄生虫、细菌或病毒引起。通过媒介传播的病毒性疾病包括登革热、基孔肯雅热、寨卡病毒热、黄热病、西尼罗河热等。

7、上述几种疾病在感染后产生的临床症状相似，而且容易产生混合感染，对临床诊断带来极大的干扰性，而且，目前单一性的虫媒原体检测耗时长，不能实现对多种病原进行快速和准确的检测和鉴别。因此，有必要建立一种快速的可同步实现大量不同病原的早期诊断方法，以节约诊断时间，以便尽快采取有效的防控措施。

技术实现思路

1、为此，本发明提出一种同时检测虫媒传染性疾病多种病原体的引物池及pcr快速检测试剂盒，能够解决单一性的虫媒原体检测耗时长的问题，通过一次pcr扩增的反应体系中可同时检测出登革病毒（denv1/2/3/4）、寨卡病毒(zikv)、基孔肯雅病毒(chikv)、西尼罗河病毒 (wnv)和黄热病毒 (yfv)8种虫媒病原体，且具有较强的特异性和较高的灵敏度。

2、基于微阵列的poct多重pcr检测系统具有多重性高和样本结果全自动，全封闭，一体化等优点。本技术针对此类多重pcr来检测虫媒传染性疾病多种病原体做了引物的体系优化，并设计了全新的引物对和探针组成的引物池，可以达到在临床上灵敏、特异性地满足对这类虫媒传染性疾病多种病原体的快速检测。

3、本发明的同时检测虫媒传染性疾病多种病原体的引物池包括如下引物对：

4、如seq id no:1所示的denv1-f正向引物，如seq id no:2所示的denv1-r反向引物；

5、如seq id no:4所示的denv2-f正向引物，如seq id no:5所示的denv2-r反向引物；

6、如seq id no:7所示的denv3-f正向引物，如seq id no:8所示的denv3-r反向引物；

7、如seq id no:10所示的denv4-f正向引物，如seq id no:11所示的denv4-r反向引物；

8、如seq id no:13所示的zikv-f正向引物，如seq id no:14所示的zikv-r反向引物；

9、如seq id no:16所示的chikv-f正向引物，如seq id no:17所示的chikv-r反向引物；

10、如seq id no:19所示的wnv-f正向引物，如seq id no:20所示的wnv-r反向引物；

11、如seq id no:22所示的yfv-f正向引物，如seq id no:23所示的yfv-r反向引物。

12、本发明的同时检测虫媒传染性疾病多种病原体的引物池还可以包括如下湮灭探针：

13、如seq id no:3所示的denv1-p湮灭探针；

14、如seq id no:6所示的denv2-p湮灭探针；

15、如seq id no:9所示的denv3-p湮灭探针；

16、如seq id no:12所示的denv4-p湮灭探针；

17、如seq id no:15所示的zikv-p湮灭探针；

18、如seq id no:18所示的chikv-p湮灭探针；

19、如seq id no:21所示的wnv-p湮灭探针；

20、如seq id no:24所示的yfv-p湮灭探针。

21、具体引物对和湮灭探针如表1所示

22、表1 引物和湮灭探针

23、

24、较佳地是，本发明所述同时检测虫媒传染性疾病多种病原体的引物池还可以包括更多的引物对和湮灭探针。

25、本发明还公开一种同时检测虫媒传染性疾病多种病原体的pcr快速检测试剂盒，包括：pcr反应液、引物池和缓冲液，其中所述引物池为本发明所述的引物池。

26、其中，pcr反应液可以为pcr反应液冻干粉，所述引物池可以为引物池冻干粉。

27、本发明所述的同时检测虫媒传染性疾病多种病原体pcr的快速检测试剂盒还可以具有pcr质控品。

28、所述pcr质控品由阳性质控品和阴性质控品组成。所述阳性质控品为质粒或假病毒标准品，所述阴性质控品为灭菌后焦碳酸二乙酯处理水。

29、所述质粒或假病毒标准品的序列如seq id no:25，seq id no:26，seq id no:27，seq id no:28，seq id no:29，seq id no:30，seq id no:31，seq id no:32所示。

30、表2 质粒或假病毒标准品的序列

31、

32、

33、所述pcr反应液包括耐热dna聚合酶、逆转录酶、rna酶抑制剂、二价镁离子（如氯化镁或硫酸镁）和三磷酸脱氧核糖核苷酸。所述缓冲液为ph=8.0的tris缓冲液。

34、所述pcr反应液冻干粉和所述引物池冻干粉用所述缓冲液配置成如下浓度的pcr反应液：耐热dna聚合酶的浓度为0.01~1单位/µl优选0.01~0.1单位/µl、逆转录酶100-400u/µl优选100-150u/µl、rna酶抑制剂30-50u/µl优选35-45u/µl、二价镁离子（如氯化镁或硫酸镁）的浓度为1~4mmol/l优选2.5~3.5mmol/l、三磷酸脱氧核糖核苷酸的浓度为10~500 µmol/l优选100~200 µmol/l、以及各引物和各湮灭探针的浓度分别为10~500nmol/l优选100~200nmol/l；最佳地是，耐热dna聚合酶的浓度为0.05单位/µl、逆转录酶125u/µl、rna酶抑制剂40u/µl、二价镁离子的浓度为3mmol/l、三磷酸脱氧核糖核苷酸的浓度为200µmol/l、以及各引物和各湮灭探针的分别浓度200nmol/l。

35、所述试剂盒还包括微阵列qpcr检测卡盒，所述微阵列qpcr检测卡盒中的每个子检测区分别固定有与对应的湮灭探针杂交的荧光核酸。

36、本发明的检测虫媒传染性疾病多种病原体pcr快速检测试剂盒于室温避光保存。

37、本发明的积极进步效果在于：本发明试剂盒还包括微阵列qpcr检测卡盒，所述微阵列qpcr检测卡盒中的每个子检测区分别固定有与对应的湮灭探针杂交的荧光核酸，每个子检测区仅固定某一种病原体的荧光核酸，如此来区分检测样本中的病原体。本发明针对此还进行了多重pcr来检测虫媒传染性疾病多种病原体做了引物的体系优化，并设计了全新的引物和探针池，可以达到在临床上灵敏、特异性地满足对虫媒传染性疾病多种病原体的快速检测。本发明的检测虫媒传染性疾病多种病原体pcr快速检测试剂盒在包括8对病原体特异性组合引物可以同时特异灵敏地检测8种虫媒传染性疾病多种病原体的靶标。

38、以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。