促间充质干细胞衍生外泌体的无血清培养基及制备和用途

本发明涉及一种间充质干细胞的无血清培养基及其制备和用途，具体地涉及一种模拟三维培养环境的促间充质干细胞衍生外泌体的无血清培养基及其制备和用途。

背景技术：

1、间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)是一种来源于中胚层的贴壁依赖性细胞，呈成纤维样，存在于骨髓、脐带、脂肪及胎盘等多种组织中。作为一种成体干细胞，mscs具有自我更新能力、多向分化潜能、免疫调节能力、归巢能力等，广泛应用于细胞治疗、组织工程等科学研究及临床治疗中。mscs的临床应用价值不仅体现在细胞本身，而且其分泌物－外泌体也具有应用价值。

2、外泌体是指直径在40nm至200nm范围内的纳米颗粒家族，存在于几乎所有生物的体液中。其通过转移生物活性物质如蛋白质、脂质及核酸等，进行细胞间通讯，参与细胞增殖和分化、血管形成、免疫调节等多种生理及病理过程，是细胞间信号传递的重要媒介之一，在临床治疗、药物传递和疾病生物标志物方面具有十分广阔的应用前景。但是，基于外泌体疗法的研究及开发仍面临许多挑战，其中主要受到给药剂量需求大、外泌体供应不足等限制。

3、mscs衍生的外泌体生产通常需要进行mscs细胞培养、收集细胞培养上清液、经分离纯化后最终得到外泌体。通常1ml培养上清液中可获得1.0×107个外泌体。然而，在动物体内实验中，每只小鼠需要消耗约1.0×108至1.0×109个外泌体；在临床试验中每位患者需要0.5×1011至1.4×1011个外泌体，因此需要扩大细胞培养规模，提高单位细胞外泌体生产能力，优化外泌体分离方法，以获得足够数量的外泌体。其中，提高单位细胞外泌体生产量是提高外泌体产量的有效途经之一。

4、在生产mscs衍生的外泌体时，mscs通常培养在添加胎牛血清的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(dulbecco’s modified eagle’s medium，dmem)中，源自血清的蛋白质、病原体及外泌体等成分可能污染最终获得的外泌体产品。为此，研究人员首先采用含血清培养基培养mscs，而后用无外泌体的含血清培养基生产mscs衍生的外泌体。虽然去除了血清中的外泌体，但血清中的其他成分仍可能对临床级别的人用外泌体产品造成污染，且血清中的不确定成分及批次间差异影响研究结果及治疗效果的可靠性。因此，需要开发外泌体生产用的无血清培养基。然而，现有的商业化无血清培养基主要为mscs细胞培养而开发，并未针对外泌体生产过程进行优化，从而导致外泌体生产的产量较低。

5、外泌体由生物膜多重内陷产生，主要涉及早期内体形成和聚集、多泡体及腔内囊泡形成、多泡体转运和分泌等过程。在细胞内，质膜向内萌发，形成早期内体(endosome)。在早期内体成熟过程中，通过转运必需内体分选复合物系统(endosomal sorting complexrequired for transport，escrt)或神经酰胺依赖性途径，使内体膜内陷，胞质中的脂质、蛋白质、核酸等“货物”被转运到腔内囊泡(intraluminal vesicles，ilvs)，形成多泡体(multivesicular bodies，mvb)，并通过rab蛋白家族调控，转运到质膜，胞吐释放腔内囊泡，最终产生外泌体。

6、基于对外泌体生物发生和分泌机制的认识，研究人员聚焦于探索促进细胞外泌体生成和分泌的关键成分。ludwig等人利用碘乙酸钠(为一种糖酵解抑制剂)和2,4-二硝基苯酚(2,4-dinitrophenol，dnp；为一种氧化磷酸化抑制剂)，同时抑制糖酵解和氧化磷酸化后，导致细胞中单磷酸腺苷(adenosine monophosphate，amp)浓度升高，腺苷a2b受体系统激活，外泌体释放增强[ludwig n,et al.sci rep.2020,10(1):6948]。li等人探究了液泡素(mopipp，为一种新型吲哚基查耳酮)和空泡蛋白-1(vacuolin-1，为一种独特的三嗪基化合物)对培养的胶质母细胞瘤和hek293t细胞中外泌体产生的影响。此二种化合物皆能在无明显细胞毒性的情况下促进次级内体的空泡化，从而干扰其向溶酶体的运输，进而促进外泌体的释放[li zh,et al.mol cell biochem.2018,439(1-2):1-9]。

7、还有一些研究人员尝试开发能促进外泌体生成的无血清培养基。例如，中国专利申请案cn114480273a以dmem/f12为基础培养基添加血清替代物、促生长因子、肌层细胞修复因子、抗衰老因子、缓冲剂、抗氧化剂、维生素、抗生素、微量元素、保护剂，开发了一款不含血清成分且成分确定、质量可控、可规模化生产外泌体的无血清培养基。中国专利申请案cn112920996a以dmem为基础培养基，通过添加表皮生长因子、转化生长因子、辅酶q10、氯化钾、果糖二磷酸钠、组胺二盐酸盐和人血清白蛋白，配制了人脐带mscs外泌体分泌的培养基，通过营造类似损伤组织的环境，激活干细胞修复机制，促使干细胞大量分泌外泌体，从而获得含有高浓度mscs衍生的外泌体培养上清。中国专利申请案cn114836375a和cn112920991a以f12培养基为基础，添加l-抗坏血酸、亚硒酸钠、nahco3和胰岛素，配制了成分简单的外泌体分泌诱导培养基，生产获得的外泌体可以有效保护神经元、改善细胞衰老。

8、此外，大量研究结果证明，相比于二维培养，三维培养能显著提高外泌体的产量。三维培养因生长面积大，可高密度扩增，且受机械刺激、传质等影响，能更好地模拟细胞在体内的形态及生长环境，影响外泌体生物发生和分泌。chen等人利用中空水凝胶纤维进行mscs高密度悬浮培养，细胞形态由长梭形变成球形，从而使单位细胞外泌体产量提高约13倍[chen jw,et al.biofabrication.2022,14(1):015012]。而kim等人采用3d球体培养技术培养mscs，细胞形态呈圆形，细胞骨架的改变使肌动蛋白部分解聚，从而促进细胞外泌体释放，将单位细胞外泌体产量提高约4.3倍[kim m,et al.tissue eng regen med.2018,15(4):427-436]。因此，三维培养通过影响细胞骨架肌动蛋白聚集/解聚状态，影响外泌体的生物发生与分泌。

9、现有的研究大多探究单个成分对外泌体生成的影响和相关作用机制，且细胞主要通过二维培养方式进行培养。然而，细胞的外泌体产量，不仅与培养过程中细胞数量和活性有关，而且涉及单位细胞的外泌体产量。通过细胞增殖，增加了产生外泌体的细胞数量，细胞活性维持则保证细胞能在更长的时间里持续产生外泌体。单位细胞外泌体生产涉及外泌体的生物发生及分泌两大过程，受到多重因素影响，如细胞来源、培养代次、细胞密度、分化程度、培养方式、外源刺激、营养物供给、细胞骨架聚集/解聚等，这些因素在促进细胞外泌体生成和分泌的无血清培养基设计及开发中均需顾及，缺一不可。其中，在二维培养环境下，模拟三维培养中细胞骨架的聚集/解聚状态，可以促进皮质肌动蛋白层部分解聚及mvb限制膜上肌动蛋白成核聚集，能更有利于提高单位细胞外泌体产量。

技术实现思路

1、因此，在满足mscs体外培养和活性维持的基础上，本发明开发出一种模拟三维培养细胞骨架聚集/解聚状态的无血清培养基以促进mscs外泌体生成和分泌，进而提高外泌体产量。

2、本发明的主要目的在于提供一种无血清培养基，所述无血清培养基包括基础培养基及添加剂，其中所述添加剂包括人血清白蛋白、羟乙基哌嗪乙硫磺酸(2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid，hepes)、氯化锂、亚硒酸钠、转铁蛋白、胰岛素、乙醇胺、维生素c、生物素、还原型谷胱甘肽、脂质浓缩液、地塞米松、聚乙烯醇、awrk6、p53通路抑制剂、p38 mapk通路抑制剂、表皮细胞生长因子(epidermal growthfactor，egf)、血小板衍生的生长因子-bb(platelet-derived growth factor-bb，pdgf-bb)、及碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bfgf)。

3、在一些实施例中，所述人血清白蛋白的浓度为0.5g/l至5g/l、所述hepes的浓度为5mm至15mm、所述氯化锂的浓度为1mm至10mm、所述亚硒酸钠的浓度为1mg/l至10mg/l、所述转铁蛋白的浓度为1mg/l至20mg/l、所述胰岛素的浓度为1mg/l至20mg/l、所述乙醇胺的浓度为1mg/l至10mg/l、所述维生素c的浓度为10mg/l至100mg/l、所述生物素的浓度为1mg/l至10mg/l、所述还原型谷胱甘肽的浓度为1mg/l至20mg/l、所述脂质浓缩液的浓度为0.1％(v/v)至1％(v/v)、所述地塞米松的浓度为1nm至10nm、所述聚乙烯醇的浓度为0.1g/l至1g/l、所述awrk6的浓度为0.5mg/l至5mg/l、所述p53通路抑制剂的浓度为1μm至10μm、所述p38mapk通路抑制剂的浓度为1μm至10μm、所述egf的浓度为10μg/l至50μg/l、所述pdgf-bb的浓度为5μg/l至50μg/l、及所述bfgf的浓度为5μg/l至50μg/l。

4、在一些实施例中，所述无血清培养基进一步包括碘乙酸钠。优选地，所述碘乙酸钠的浓度为1μm至10μm。

5、在一些实施例中，所述无血清培养基进一步包括青蒿素、白藜芦醇、及鸟苷5’-二磷酸(guanosine 5’-diphosphate，gdp)。优选地，所述青蒿素的浓度为5μm至20μm、所述白藜芦醇的浓度为5μm至20μm、及所述gdp的浓度为5μm至20μm。

6、在一些实施例中，所述p53通路抑制剂为pifithrin-α，及所述p38 mapk通路抑制剂为sb 202190。

7、在一些实施例中，所述转铁蛋白为重组人转铁蛋白，所述胰岛素为重组人胰岛素，所述egf为重组人egf，所述pdgf-bb为重组人pdgf-bb，及所述bfgf为重组人bfgf。

8、在一些实施例中，所述脂质浓缩液包括花生四烯酸、胆固醇、dl-α-生育酚醋酸、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸、及硬脂酸。

9、在一些实施例中，所述基础培养基包括dmem/f12、α-mem或dmem。

10、本发明的另一目的在于提供一种无血清培养基的制备方法，所述方法包括以下步骤：

11、(1)将添加剂溶于超纯水、无水乙醇或二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，dmso)

12、中配成母液；以及

13、(2)将所述母液溶于一基础培养基中，并过滤除菌，以得到一无血清培养基，

14、其中所述添加剂包括人血清白蛋白、羟乙基哌嗪乙硫磺酸、氯化锂、亚硒酸钠、转铁蛋白、胰岛素、乙醇胺、维生素c、生物素、还原型谷胱甘肽、脂质浓缩液、地塞米松、聚乙烯醇、awrk6、p53通路抑制剂、p38 mapk通路抑制剂、egf、pdgf-bb、及bfgf。

15、在一些实施例中，所述方法进一步包括于步骤(1)中添加碘乙酸钠。

16、在一些实施例中，所述方法进一步包括于步骤(1)中添加青蒿素、白藜芦醇、及gdp。

17、在一些实施例中，所述脂质浓缩液为花生四烯酸、胆固醇、dl-α-生育酚醋酸、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、或其一组合。

18、在一些实施例中，所述基础培养基包括dmem/f12、α-mem或dmem。

19、优选地，所述过滤除菌所使用滤膜的孔径为0.1～0.3μm，特别优选地为0.22μm。

20、本发明的又一目的在于提供一种所述无血清培养基的用途，用于促进mscs的体外培养及增殖、维持所述体外培养的mscs的细胞活性、促进所述mscs外泌体的生成及分泌、及制备包含所述mscs的外泌体的产品。

21、在一些实施例中，所述mscs为所述人脐带mscs。