一种人乳腺叶状肿瘤类器官培养基及培养方法和应用与流程

本发明涉及生物医学，尤其涉及一种人乳腺叶状肿瘤类器官培养基及培养方法和应用。

背景技术：

1、乳腺叶状肿瘤(phyllodes tumor，pt)是发生于乳腺的纤维上皮性肿瘤，以乳腺间质细胞肿瘤性增生为主要特征，形态学特点为：双层的上皮成分呈裂隙状或腺管状排列，周围绕以丰富的间质细胞成分，形成叶状结构。叶状肿瘤好发于年轻女性，亚裔女性发病率高于西方女性。恶性叶状肿瘤具有较高的复发率和转移率，预后差。根据肿瘤边界、核分裂象、间质细胞密度、细胞异型性、间质过度增生以及是否存在异源性成分，将叶状肿瘤分为良性、交界性和恶性。大多数叶状肿瘤是良性的，但复发并不少见；恶性叶状肿瘤生长速度快，侵袭性强，易复发。现有的分子标记物在预测叶状肿瘤的生物学进展方面的价值十分有限，而在乳腺叶状肿瘤的临床治疗中，化疗和放疗对叶状肿瘤的治疗效果均不佳，其治疗方式仍以手术切除为主，但术后局部复发率较高，22％左右的恶性叶状肿瘤会发生转移。

2、因此，乳腺叶状肿瘤的发生、发展机制的研究以及相关临床诊治方案的探索和改进一直都是亟待解决的问题，而建立良好的人乳腺叶状肿瘤细胞实验模型是开展相关研究的基础之一。病人来源的类器官(patient-derived organoids，pdo)的3d培养为乳腺叶状肿瘤的研究提供了一个更加有效和可靠的模型。与二维培养的细胞相比。类器官培养可以更好的保持原代肿瘤组织的异质性，与其来源的组织样本具有高度的一致性。此外，还可用于药物敏感性检测、疾病建模、研究耐药机制、疾病发生发展等研究。但是乳腺叶状肿瘤类器官的培养目前还没有一个标准的构建方法。

3、现有技术公开了一种乳腺叶状肿瘤类器官的构建方法，但其步骤实际为乳腺上皮类器官的构建方法，通过展示的结果图显示，其获得的类器官仅仅只有腺上皮成分，乳腺叶状肿瘤中最主要的间质纤维成分并未成功构建，所以并非真正的乳腺叶状肿瘤类器官。同样，也有技术简短的提到了乳腺叶状肿瘤类器官的构建，但其步骤同样为乳腺上皮的培养方法，获得的类器官仅仅只有腺上皮成分，而且并未进行病理学鉴定。

4、因此，目前已知的关于乳腺叶状肿瘤类器官的构建方法并未成熟，尚未真正构建出如本技术所述的具有上皮和间质双向分化的乳腺叶状肿瘤类器官。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种具有乳腺上皮和间质双重成分的叶状肿瘤类器官的培养方法。

2、第一方面，本发明提供了一种人乳腺叶状肿瘤类器官培养基，包括以下组分：

3、基础培养基、glutamax、hepes、b27 supplement、n-acetylcysteine、nicotinamide、human r-spondin 3protein、human noggin、human heregulinβ-1、humanfgf-10、human fgf-7、human egf、a83-01、sb 202190、primocin、fbs、bfgf。

4、优选的是，所述基础培养基为advanced dmem/f12；

5、所述培养基中glutamax的浓度为1～3nm、hepes的浓度为8～12mm、b27supplement的体积浓度为1～3％、n-acetylcysteine的浓度为1～2mm、nicotinamide的浓度为8～12mm、human r-spondin 3protein的浓度为240～260ng/ml、human noggin的浓度为90～110ng/ml、human heregulinβ-1的浓度为4～6nm、human fgf-10的浓度为18～22ng/ml、human fgf-7的浓度为3～7ng/ml、human egf的浓度为3～7ng/ml、a 83-01的浓度为490～510nm、sb 202190的浓度为0.8～1.2μm、primocin的浓度为50～100μg/ml、fbs的体积浓度为5～10％，bfgf的浓度为8～12ng/ml。

6、第二方面，本发明还提供了一种所述的人乳腺叶状肿瘤类器官培养基在培养人乳腺叶状肿瘤类器官中的应用。

7、第三方面，本发明还提供了一种人乳腺叶状肿瘤类器官的培养方法，包括以下步骤：

8、将乳腺叶状肿瘤组织剪碎，于培养瓶中静置培养，待细胞从组织块边缘游离长出，至预定细胞密度后传代；经稳定传代后，得到人乳腺叶状肿瘤间质纤维细胞；

9、将乳腺叶状肿瘤组织剪碎、洗涤后加入消化液消化，研磨过滤得到细胞悬液，离心收集细胞；

10、用人乳腺上皮类器官培养基重悬细胞，加入matrigel混合，待混合液凝固后，再加入人乳腺上皮类器官培养基，继续培养，至有叶状肿瘤乳腺上皮球状体形成；

11、将人乳腺叶状肿瘤间质纤维细胞与球状体分别消化为单个细胞后混匀，再加入人乳腺叶状肿瘤类器官培养基，继续培养，至有间质纤维包绕腺体的3d类器官形成；

12、其中，所述人乳腺叶状肿瘤类器官培养基为所述的人乳腺叶状肿瘤类器官培养基。

13、优选的是，所述人乳腺上皮类器官培养基包括以下浓度的组分：

14、advanced dmem/f12；

15、1～3nm的glutamax；

16、8～12mm的hepes；

17、体积浓度为1～3％的b27 supplement；

18、1～2mm的n-acetylcysteine；

19、8～12mm的nicotinamide；

20、240～260ng/ml的human r-spondin 3protein；

21、90～110ng/ml的human noggin；

22、4～6nm的human heregulinβ-1；

23、18～22ng/ml的human fgf-10；

24、3～7ng/ml的human fgf-7；

25、3～7ng/ml的human egf；

26、490～510nm的a83-01；

27、0.8～1.2μm的sb 202190；

28、50～100μg/ml的primocin。

29、优选的是，将乳腺叶状肿瘤组织剪碎，分散在培养瓶底部，将培养瓶瓶底朝上放置于36～37℃、体积浓度为5.0％的co2培养箱内静置培养；次日，将培养瓶正置，加入培养基，每2～3天更换一次培养基，待细胞从组织块边缘游离长出，直至细胞密度为75～85％传代；

30、在培养瓶中加入trypsin-edta，于36～37℃下消化2～3min，待细胞变圆后加入培养基终止消化，离心，弃上清；用培养基重悬细胞，转移至培养皿中，放置于36～37℃、体积浓度为5.0％的co2培养箱内静置培养，得到人乳腺叶状肿瘤间质纤维细胞；

31、其中，所述培养基包括advanced dmem/f12、fbs和penicillin streptomycin，fbs体积浓度为5～10％，penicillin streptomycin体积浓度为0.5～1.5％。

32、优选的是，将乳腺叶状肿瘤组织剪碎、洗涤后加入消化液，放置于36～37℃的培养箱消化45～60min后取出；向消化后的组织混合液加入人乳腺上皮类器官培养基终止消化，震荡，采用细胞过滤筛过滤细胞悬液，弃去未消化完全的胶原组织残余；将过滤好的细胞悬液离心，收集细胞；所述消化液为1～2mg/ml的collagenase type iv；

33、用人乳腺上皮类器官培养基重悬细胞，按体积比(1～2):(1～2)的比例加入matrigel混合至混合液凝固，再加入人乳腺上皮类器官培养基，继续培养，至有叶状肿瘤乳腺上皮球状体形成。

34、优选的是，使用trypsin-edta消化人乳腺叶状肿瘤间质纤维细胞；使用trypleexpress enzyme消化叶状肿瘤乳腺上皮球状体，得到消化的乳腺上皮细胞；

35、将消化的人乳腺叶状肿瘤间质纤维细胞和消化的乳腺上皮细胞按数量比(2～3):1混合，加入matrigel和人乳腺叶状肿瘤类器官培养基重悬，孵育，再加入人乳腺叶状肿瘤类器官培养基，继续培养，人乳腺叶状肿瘤类器官培养基每2～3天更换一次，至有间质纤维包绕腺体的3d类器官形成。

36、第四方面，本发明还提供了一种所述的培养方法培养得到的人乳腺叶状肿瘤类器官在制备、筛选或评估抗肿瘤药物试剂中的应用。

37、第五方面，本发明还提供了一种所述的培养方法培养得到的人乳腺叶状肿瘤类器官在研究肿瘤致病机制、发生、发展或转移中的应用。

38、本发明的人乳腺叶状肿瘤类器官培养基及培养方法相对于现有技术具有以下有益效果：

39、1、本发明的人乳腺叶状肿瘤类器官培养基，包括基础培养基、glutamax、hepes、b27 supplement、n-acetylcysteine、nicotinamide、human r-spondin 3protein、humannoggin、human heregulinβ-1、human fgf-10、human fgf-7、human egf、a83-01、sb202190、primocin、fbs、bfgf；本发明的人乳腺叶状肿瘤类器官培养基，可用于构建同时具有乳腺上皮和间质两种成分的叶状肿瘤类器官；

40、2、本发明的人乳腺叶状肿瘤类器官的培养方法，通过对叶状肿瘤类器官培养方法的不断改进，摸索和验证出一套更加成熟、稳定的培养方法。相比于现有技术中乳腺叶状肿瘤类器官培养体系和方法，操作步骤和方法上的主要改进包括：本发明构建的叶状肿瘤类器官同时具有乳腺上皮和间质两种成分，是真正意义上的叶状肿瘤模型；本发明提供的人乳腺叶状肿瘤类器官，构建方法简单，生物遗传性稳定，能有效模拟乳腺叶状肿瘤组织。以该类器官作为研究模型，相较于传统二维肿瘤细胞模型，能更好的模拟乳腺叶状肿瘤的组织学特性，提高了药物筛选敏感性和特异性；相较于患者来源的异种移植物动物模型，降低了研究周期，提高了造模成功率，具有较高的科研和临床应用价值。