一种酮还原酶在毕赤酵母中高表达的方法及其应用与流程

本发明涉及生物工程，具体涉及一种酮还原酶在毕赤酵母中高表达的方法及其应用。

背景技术：

1、酮还原酶(keto reductase，简称kred)是酶催化法制备手性醇的关键酶。(r)-(-)-1，3-丁二醇(英文名为(r)-(-)-1，3-butanediol)，是一种较为昂贵的手性醇化合物，酮还原酶可以不对称地将4-羟基-2-丁酮转化为(r)-(-)-1，3-丁二醇。酶法制备(r)-(-)-1，3-丁二醇相较于化学法表现出环境友好、立体选择性高和转化效率高等优势，因此越来越受人们的青睐。为了推动酮还原酶在工业生产中的应用，利用分子生物学方法将酮还原酶基因进行定向进化并进行异源表达以提高酮还原酶的活性和表达水平，是目前普遍采用的酮还原酶的制备方式。

2、目前常用的是利用基因工程技术构建酮还原酶大肠杆菌表达系统，对酮还原酶进行异源表达和微生物发酵生产。由于大肠杆菌表达系统多为胞内表达，自身胞内表达蛋白较多，后期纯化成本高，在大规模发酵培养过程中容易污染噬菌体而发生倒灌现象，此外，在食品、医药领域，大肠杆菌表达系统表达重组外源蛋白会有细菌内毒素残留的影响。毕赤酵母表达系统是近些年来发展起来的应用广泛的真核表达系统，毕赤酵母菌属于单细胞真核微生物，具有生长力旺盛、营养条件简单、发酵技术成熟、ph适应范围较宽、不产生有毒物质、没有噬菌体污染等优点，且已经在国际上被列为生物安全菌株，因此目前用该菌株应用于工业酶的重组表达使用较为广泛。

3、目前报道的生产(r)-(-)-1，3-丁二醇的酮还原酶均在大肠杆菌系统中表达，尚未见到在毕赤酵母系统中表达生产该酮还原酶。其中专利cn111321129a公开了一种工程化酮还原酶多肽及其应用，提供了可用于在工业相关条件下不对称合成手性醇化合物的工程化酮还原酶多肽的氨基酸序列、制备方法及其反应工艺。本公开内容还提供了编码工程化酮还原酶多肽的多核苷酸序列、能够表达工程化酮还原酶多肽的重组工程菌和使用工程化酮还原酶多肽生产手性醇化合物的方法。与其他制备方法相比，本发明提供的工程化酮还原酶多肽的活性和热稳定性更好，允许使用热处理的方式对酶液进行提纯，非常有利于酶的生产及酶促反应的工业化应用，大大简化了手性醇化合物的生产过程。该专利中的目标酮还原酶是在大肠杆菌宿主中进行的表达，但是由于大肠杆菌的胞内表达，会给后续的产物提纯增加负担和成本，同样会造成最终产物收率的下降。

4、专利cn116410945a公开了一种酮还原酶突变体及其应用，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列与seq id no：3相比，存在第154位氨基酸残基差异；以及，第199位氨基酸残基差异，和/或第203位氨基酸残基差异，还公开了编码所述酮还原酶突变体的核酸、包含所述核酸的重组表达载体以及包含所述核酸或重组表达载体的转化体，还公开了所述酮还原酶突变体的制备方法、包含所述酮还原酶突变体的催化剂。该专利中的催化生产(r)-(-)-1，3v丁二醇的酶同样是在大肠杆菌中进行表达，具有上述所述的提纯复杂的问题，另一方面，该专利公开的酶耐受温度20～45℃，还存在热稳定性差的问题。

技术实现思路

1、针对目前酮还原酶催化生产(r)-(-)-1，3-丁二醇的工艺中存在的以大肠杆菌作为宿主细胞，后续产品提纯困难，以及热稳定性差的问题，本发明提供了一种酮还原酶在毕赤酵母中高表达的方法及其应用。

2、为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

3、一种酮还原酶，所述酮还原酶的编码基因具有seq id no.1所示的核苷酸序列。

4、一种酮还原酶，所述酮还原酶具有seq id no.2所示的氨基酸序列。

5、一种重组载体，包括上述酮还原酶编码基因，所述编码基因的拷贝数为1-6。

6、进一步地，所述的载体是phbm905bdm质粒，所述编码基因的拷贝数为6。

7、一种包括上述重组载体的工程菌。

8、优选地，所述工程菌为毕赤酵母菌。

9、一种工程菌的构建方法，包括以下步骤：

10、(1)将核苷酸序列为seq id no.1基因片段克隆到质粒phbm905bdm上，获得重组载体phbm905bdm-chkred-1；

11、(2)将步骤(1)获得的重组载体phbm905bdm-chkred-1通过生物砖技术将整个酮还原酶的表达框重复构建获得2-6拷贝的重组载体；

12、(3)将步骤(2)获得的载体采用限制性内切酶sali线性化回收后，分别转化至宿主细胞中，通过组氨酸缺陷型平板md筛选，经过阳性重组子鉴定，得到1-6不同核苷酸序列拷贝数的工程菌株。

13、进一步地，所述步骤(3)中的宿主细胞为毕赤酵母gs115菌株。

14、培养上述工程菌，从培养物中获得酮还原酶。

15、进一步地，所述工程菌的发酵培养方法，包括如下步骤：

16、(1)种子液的获得：将冻存的工程菌划线到ypd平板上培养，培养完成后挑取单菌落接种到种子培养基培养至对数生长中期，获得种子液；

17、(2)发酵培养：将种子液以体积1-10％的接种量接种到发酵培养基中发酵，发酵结束后获得含酮还原酶的发酵液。

18、进一步地，所述ypd平板组成如下：酵母粉10g/l、蛋白胨20g/l、葡萄糖10g/l、琼脂粉15g/l，溶剂为去离子水；

19、所述种子培养基组成：酵母粉10g/l、蛋白胨20g/l、葡萄糖10g/l，溶剂为去离子水，ph为7.0；

20、所述发酵培养基质量组成：26.7ml/l的85％磷酸，0.93g/l的硫酸钙，18.2g/l的硫酸钾，14.9g/l的mgso4·7h2o，4.13g/l的氢氧化钾，40g/l的甘油，4.35ml/l ptm1缓冲液，溶剂为去离子水，ph5.0。

21、一种如上述酮还原酶在制备(r)-1，3-丁二醇中的应用。

22、本发明具有如下所述的有益效果：

23、1、本发明提供的一种酮还原酶在毕赤酵母中高表达的方法及其应用，采用体外构建多拷贝表达重组载体的构建方法，得到高拷贝数的重组菌，无需通过大量筛选得到高拷贝菌株，工作量大大降低，而且拷贝数都是确定的，可以构建1-6拷贝的任意拷贝数的表达菌株，重组酮还原酶酶活高，表达量高。

24、2、本发明提供的一种酮还原酶在毕赤酵母中高表达的方法及其应用，由于毕赤酵母表达外源蛋白时会发生糖基化修饰，提高了外源蛋白的热稳定性，相较于大肠杆菌表达的蛋白，毕赤酵母表达的酮还原酶热稳定性得到了进一步的提高。

25、3、本发明提供的一种酮还原酶在毕赤酵母中高表达的方法及其应用，直接发酵生产酮还原酶，毕赤酵母具有食品安全性特点，发酵过程不添加抗生素，发酵制备的酮还原酶适合用于食品和医药行业。

技术特征：

1.一种酮还原酶，其特征在于，所述酮还原酶的编码基因具有seq id no.1所示的核苷酸序列。

2. 一种酮还原酶，其特征在于，所述酮还原酶具有seq id no.2所示的氨基酸序列。

3.一种重组载体，其特征在于，包括权利要求1所述酮还原酶的编码基因；

4.一种包括权利要求3所述的重组载体的工程菌；

5.一种权利要求4所述的工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的工程菌的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）中的宿主细胞为毕赤酵母gs115菌株。

7.培养如权利要求5所述的工程菌，从培养物中获得酮还原酶。

8.根据权利要求7所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌的发酵培养方法，包括如下步骤：

9.根据权利要求8所述的工程菌，其特征在于，所述ypd平板组成如下：酵母粉10g/l、蛋白胨20g/l、葡萄糖10g/l、琼脂粉15g/l，溶剂为去离子水；

10.一种如权利要求4～9任一项工程菌获得的酮还原酶在制备(r)-1,3-丁二醇中的应用。

技术总结本发明提供了一种酮还原酶，所述酮还原酶的编码基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，同时公开了一种包括上述酮还原酶编码基因的重组载体，所述编码基因的拷贝数为1‑6，以及一种包括上述重组载体的工程菌，所述工程菌为毕赤酵母菌，并且包括该工程菌的发酵培养方法。本发明采用体外构建多拷贝表达重组载体的构建方法，得到高拷贝数的重组菌，无需通过大量筛选得到高拷贝菌株，工作量大大降低，而且拷贝数都是确定的，可以构建1‑6拷贝的任意拷贝数的表达菌株，重组酮还原酶酶活高，表达量高。技术研发人员：陈晚苹,孙保国,陈海滨,吴鑫炜,孙磊,周磊,贺聪立,周丽,彭沁利,刘思彤,张城孝受保护的技术使用者：宁波酶赛生物工程有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/13