一种免样品处理的hmC的定量分析方法

本发明涉及基因工程，具体地说是涉及一种免样品处理的hmc的定量分析方法。

背景技术：

1、5-羟甲基胞嘧啶(hmc)是生物体内普遍存在的表观遗传修饰，它是由tet家族酶氧化5-甲基胞嘧啶(5mc)产生的。研究表明，hmc参与了基因表达调控(seung-gi jin等，2011)，其与胚胎发育、神经系统功能以及肿瘤发生高度相关。越来越多的研究发现，hmc可作为疾病诊断和治疗的潜在标志物，在包括黑色素、恶性神经胶质瘤、肝癌等在内的肿瘤中缺乏hmc表达。因此，准确检测hmc对揭示其功能和机理具有重要意义。

2、在早期研究中，科学家用薄层色谱(tlc)、高效液相色谱(hplc)或者质谱(ms)等仪器来建立hmc的定量分析方法。然而，这些方法只能检测dna样本中hmc的总含量，而不能测定hmc在基因组上的分布以及特定位点hmc的含量。

3、随着科学技术的发展，科学家基于高通量测序技术发展了能在单碱基分辨率上准确测定hmc的分析方法，如氧化亚硫酸氢盐测序(oxbs-seq)、tet辅助亚硫酸氢盐测序(tab-seq)和基于富集的测序方法(ebs-seq)。这些方法虽然能在单碱基分辨率上绘制hmc在基因组上的分布并定量hmc的相对丰度。但是，高通量的测序方法步骤繁琐、耗时长、花费高，仅适用于基因组dna上大量hmc的分析。若采用高通量测序方法对少量的特定位点的hmc的含量进行定量分析，则显得资源浪费。

4、目前存在的特定位点hmc的分析方法有硼酸介导的聚合酶链式反应(pcr)分析方法(c.zhao et al.,2014)、基于连接反应的滚环扩增方法(z.y.wang et al.,2018)、hpaii介导的连接-pcr法(z.y.wang et al.,2019)、过氧钨酸钾氧化介导的两相扩增系统(pom-tpas)法(z.y.wang et al.,2020)和免化学氧化法(l.sun et al.,2022)。然而，这些方法都需要对dna样品进行预处理，或者进行酶切和oxbs反应，或者进行化学氧化反应，或者进行酶处理反应，其不仅操作繁琐，而且经化学试剂处理的dna会受到一定的损伤，并影响dna回收率；若用酶来处理dna样品，由于生物酶价格较高，又会增加成本。因此，迫切需要发展不需要样品处理的hmc的分析方法。

5、冯蕊(冯蕊，2021)提供了一种基于错配探针的连接酶链式反应结合成像流式微球技术检测hmc的方法，该方法虽然实现了免样品处理，但是检测时hmc与c和mc的区分度不好，特异性有待提高，灵敏度也较低，不能实现对实际样本的检测。此外，该方法需要用磁球来富集dna样本，孵育时间长，清洗步骤繁琐，重现性差；而且其中所使用的流式细胞仪非常昂贵，成本很高，不利于推广使用。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种免样品处理的hmc的定量分析方法，该方法无需dna样品处理、操作简单、选择性好、灵敏度高、特异性好，能够实现对实际样本的检测。

2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、一种免样品处理的hmc的定量分析方法，包括以下步骤：

4、(1)将含有hmc的目标链与其互补链杂交成为目标双链；

5、(2)根据目标链dna序列，设计连接探针1和连接探针2，所述连接探针1从5′端到3′端依次为pcr扩增引物区、无关区、模板识别区，其3′端最末一个碱基是识别碱基a，该碱基与模板序列上的待测位点碱基相对；所述连接探针2从3′端到5′端依次为pcr扩增引物区、无关区、模板识别区；所述连接探针1和连接探针2的模板识别区是与含有待测位点的dna序列互补的8～20个碱基序列；所述待测位点碱基为hmc、mc或c；

6、(3)将连接探针1和连接探针2与目标双链杂交，然后加入连接酶进行连接反应；

7、(4)以步骤(3)的连接产物为模板进行聚合酶链式反应或环介导的恒温扩增反应，并加入sybr green i荧光染料，实时检测荧光信号，根据预先测定的实时荧光标准曲线确定目标链hmc的含量。

8、进一步的，所述连接探针1和连接探针2的模板识别区是与含有待测位点的dna序列互补的16～18个碱基序列。

9、进一步的，步骤(3)中加入连接酶后，首先将反应体系置于94℃条件下进行高温变性，然后降温至45-59℃进行连接反应。

10、进一步的，步骤(3)所述连接酶为hifi taq dna连接酶、t4 dna连接酶或splintr连接酶。

11、进一步的，步骤(4)所述sybr green i的浓度为0.4-0.8x。

12、本发明通过筛选能够与hmc特异性连接的连接酶和探针，结合连接-聚合酶链式反应(pcr)或连接-环介导的恒温扩增反应(lamp)建立了一种新的免样品处理的hmc的定量分析方法。所述连接探针1的3′端的模板识别区和连接探针2的5′端的模板识别区与模板序列上含有待测位点的部分dna序列互补杂交，当模板序列上待测位点为hmc时，连接探针1和连接探针2可以通过特定的连接酶连接成为一个长链dna；进而在以该连接产物作为模板进行pcr或lamp扩增时，能够得到很明显的实时荧光曲线；最后可根据标准曲线图来定量实际样品中hmc的含量。而当待测位点为c或mc时，本发明所述连接酶的连接效率被明显抑制，pcr或lamp扩增产物明显减少；进而在以该连接产物作为模板进行pcr或lamp扩增时，并不能产生实时荧光曲线或者荧光曲线不明显。

13、本发明的有益效果在于：

14、本发明提供了一种免样品处理的hmc的定量分析方法，该方法首次基于错配探针和连接-pcr或lamp反应建立，其综合性能很好，不仅灵敏度高，而且特异性好，能够真正实现对实际样本的检测。仅用一步扩增方法，就能准确测定200am的hmc，而且能很好地区分开hmc与c和mc，其中，c对hmc的干扰仅有0.13％，mc对hmc的干扰仅为0.95％。此外，由于本发明方法不需要对dna样品进行任何化学处理或酶处理即可检测hmc，不仅降低了对dna样品的损伤，而且操作步骤简单，大大减少了时间和金钱成本，有利于大范围推广使用。

技术特征：

1.一种免样品处理的hmc的定量分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的免样品处理的hmc的定量分析方法，其特征在于，所述连接探针1和连接探针2的模板识别区是与含有待测位点的dna序列互补的16～18个碱基序列。

3.根据权利要求1所述的免样品处理的hmc的定量分析方法，其特征在于，步骤（3）中加入连接酶后，首先将反应体系置于94℃条件下进行高温变性，然后降温至45-59℃进行连接反应。

4.根据权利要求1所述的免样品处理的hmc的定量分析方法，其特征在于，步骤（3）所述连接酶为hifi taq dna 连接酶、t4 dna连接酶或splintr连接酶。

5.根据权利要求1所述的免样品处理的hmc的定量分析方法，其特征在于，步骤（4）所述sybr green i的浓度为0.4-0.8 x。

技术总结本发明提供了一种免样品处理的hmC的定量分析方法。本发明首先将含有hmC的目标链与其互补链杂交成为目标双链，然后根据目标链DNA序列设计了连接探针1和连接探针2，连接探针1的3′端的模板识别区和连接探针2的5′端的模板识别区与模板序列上含有待测位点的部分DNA序列互补杂交，当模板序列上待测位点为hmC时，连接探针1和连接探针2可以通过特定的连接酶连接成为一个长链DNA；在此基础上，以上述连接产物作为模板进行聚合酶链式反应或环介导的恒温扩增反应时，能够得到很明显的实时荧光曲线，进而可根据预先测定的标准曲线图来定量实际样品中hmC的含量。本发明无需样品处理，灵敏度高、特异性好，时间和金钱成本也较低。技术研发人员：严景丽,赵佳卉,苏明,时国雨受保护的技术使用者：河北大学技术研发日：技术公布日：2024/6/13