一种CAR-T细胞的制备方法与流程

本发明涉及免疫细胞治疗，更具体地涉及一种car-t细胞的制备方法。

背景技术：

1、随着对肿瘤认识的不断深入，肿瘤治疗技术取得了很大的进步，显著改善了整体肿瘤治疗效果，但多或少存在副作用大、易产生耐药性等问题。目前，肿瘤生物免疫治疗已成为一种新的治疗手段。

2、免疫细胞治疗包括car-t免疫疗法、nk免疫疗法、dc免疫疗法、til免疫疗法等。免疫细胞治疗需要进行细胞增殖，细胞增殖一般包括细胞复苏、细胞活化、基因编辑、传代培养等。然而肿瘤患者免疫细胞状态较差，而且一般会经过冻存，进一步降低细胞活性，影响免疫细胞的扩增倍数。

3、nad+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，简称为辅酶ⅰ)是体内很多脱氢酶的辅酶，连接三羧酸循环和呼吸链，其功能是将代谢过程中脱下来的氢传递给黄素蛋白。nad+能够报证细胞能量供给，促进细胞再生。cn112472710a公开了补充nad+前体物质能增强多种肿瘤对免疫检查点抑制剂的敏感性。

4、nad+对免疫细胞培养的影响，特别是肿瘤患者免疫细胞培养的影响，目前还未有文献报道。

技术实现思路

1、本发明的目的在于使用含有nad+或其前体的培养基处理免疫细胞，促进免疫细胞的扩增与提高细胞活性。

2、本发明提供了一种免疫细胞制备方法，其特征在于，包括：用含有nad+或其前体的培养基处理免疫细胞的步骤。

3、在一些实施方案中，所述免疫细胞是免疫效应细胞(杀伤细胞)或抗原呈递细胞，例如选自t细胞、肿瘤浸润淋巴(til)细胞、自然杀伤(nk)细胞、自然杀伤t(nkt)细胞、dc细胞、巨噬细胞和b细胞。

4、在一些实施方案中，所述免疫细胞为免疫效应细胞和抗原呈递细胞。

5、在一些实施方案中，所述免疫效应细胞还含有嵌合抗原受体的编码序列和/或能够表达嵌合抗原受体。

6、在一些实施方案中，所述抗原呈递细胞还负载有肿瘤抗原或含有肿瘤抗原的编码序列。

7、在一些实施方案中，所述免疫细胞还含有抗体的编码序列和/或能够表达抗体。在一些实施方案中，所述抗体是单域抗体。在一些实施方案中，所述单域抗体是多特异性单域抗体。

8、在一些实施方案中，所述方法包括如下步骤：

9、(1)从对象获得免疫细胞；

10、(2)使用含有激活剂的第一培养基处理免疫细胞，获得激活的免疫细胞，

11、(3)将含有嵌合抗原受体编码序列的核酸引入该激活的免疫细胞中，获得基因修饰的免疫细胞；

12、(4)使用第二培养基培养该基因修饰的免疫细胞；

13、其中，所述第一培养基和/或所述第二培养基为含有nad+或其前体的培养基。

14、在一些实施方案中，所述方法包括如下步骤：

15、(1)使抗原呈递细胞负载肿瘤抗原或引入肿瘤抗原的编码序列；

16、(2)从对象获得免疫效应细胞；

17、(3)在含有nad+或其前体的培养基中，将免疫效应细胞与所述抗原呈递细胞共培养足以激活所述免疫效应细胞的时间，得到激活的免疫效应细胞。

18、在一些实施方案中，所述免疫效应细胞选自t细胞或nk细胞，优选地为t细胞。

19、在一些实施方案中，所述抗原呈递细胞在负载肿瘤抗原或引入肿瘤抗原的编码序列之前和/或之后使用第三培养基培养。第三培养基也可以是含有nad+或其前体的培养基。

20、在一些实施方案中，所述nad+前体选自色氨酸、喹啉酸、烟酸(na)、烟酰胺(nam)、烟酰胺单核苷酸(nmn)、烟酰胺核糖核苷(nr)、或其食品学或药学上可接受的盐、衍生物或前药中的一种或多种；优选为烟酰胺单核苷酸(nmn)。

21、在一些实施方案中，所述培养基中nad+或其前体的浓度为1-300μm，优选为50-200μm。

22、在一些实施方案中，所述培养基还含有类黄酮和/或辅酶；

23、在一些实施方案中，所述类黄酮选自槲皮素、二氢槲皮素(dhq)、非瑟酮、儿茶素、没食子素、白藜芦醇、橙皮素中的一种或多种，优选为槲皮素和/或二氢槲皮素；

24、在一些实施方案中，所述辅酶选自谷胱甘肽或其衍生物、三磷酸腺苷及其衍生物、吡咯喹啉醌或其衍生物、腺苷蛋氨酸或其衍生物、辅酶a或其衍生物、辅酶q类或其衍生物中的至少一者，优选为吡咯喹啉醌和/或辅酶q10。

25、在一些实施方案中，所述培养基中类黄酮的浓度为0-10nm，优选为0.1-10nm，更优选为1-5nm。

26、在一些实施方案中，所述培养基中辅酶的浓度为0-10nm，优选为0.1-10nm，更优选为0.1-1nm。

27、在一些实施方案中，所述对象为健康人或肿瘤患者，优选为肿瘤患者。

28、在一些实施方案中，所述方法具备如下任一或多个特征：

29、a、步骤(2)中，激活剂选自以下的一种或多种：cd3抗体、cd28抗体、4-1bb抗体、4-1bbl抗原，

30、b、步骤(2)中，处理时间为12-84小时，优选24-72小时，

31、c、步骤(3)中，引入方法为电转，

32、d、步骤(3)中，含有多肽编码序列的核酸为核酸构建体，例如表达载体，优选地，所述表达载体是非病毒载体，

33、e、步骤(4)中，培养时间为3-10天。

34、本申请另一方面提供一种t细胞培养基，其含有nad+或其前体。

35、在一些实施方案中，所述nad+前体选自色氨酸、喹啉酸、烟酸(na)、烟酰胺(nam)、烟酰胺单核苷酸(nmn)、烟酰胺核糖核苷(nr)、或其食品学或药学上可接受的盐、衍生物或前药中的一种或多种；优选为烟酰胺单核苷酸(nmn)。

36、在一些实施方案中，所述培养基中nad+或其前体的浓度为1-300μm，优选为50-200μm。

37、在一些实施方案中，所述培养基还含有类黄酮和/或辅酶。

38、在一些实施方案中，所述类黄酮选自槲皮素、二氢槲皮素、非瑟酮、儿茶素、没食子素、白藜芦醇、橙皮素中的一种或多种，优选为槲皮素和/或二氢槲皮素。

39、在一些实施方案中，所述辅酶选自谷胱甘肽或其衍生物、三磷酸腺苷及其衍生物、吡咯喹啉醌或其衍生物、腺苷蛋氨酸或其衍生物、辅酶a或其衍生物、辅酶q类或其衍生物中的至少一者，优选为吡咯喹啉醌和/或辅酶q10。

40、在一些实施方案中，所述培养基中类黄酮的浓度为0-10nm，优选为0.1-10nm，更优选为1-5nm。

41、在一些实施方案中，所述培养基中辅酶的浓度为0-10nm，优选为0.1-10nm，更优选为0.1-1nm。

技术特征：

1.一种嵌合抗原受体t细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对象为健康人或肿瘤患者。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对象为肿瘤患者。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，激活剂选自以下的一种或多种：cd3抗体、cd28抗体、4-1bb抗体、4-1bbl抗原；

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述核酸构建体为pc23s-1444质粒，pc23s-1444质粒的核苷酸序列如seq id no:1所示。

技术总结本发明提供一种T细胞制备方法，包括：用含有NAD<supgt;+</supgt;或其前体的培养基处理T细胞的步骤，培养基还可以含有PQQ和DHQ，其中，所述T细胞还含有嵌合抗原受体的编码序列和/或能够表达嵌合抗原受体。培养基中加入上述小分子，可以提高T细胞增殖、CAR阳性率和抑制T细胞衰老。技术研发人员：张欣蕊,孙艳,钱其军受保护的技术使用者：北京细胞治疗集团有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/13