一种高危型人乳头瘤病毒的多重PCR检测试剂盒的制作方法

本发明涉及分子生物学，具体而言，涉及一种高危型人乳头瘤病毒的多重pcr检测试剂盒。

背景技术：

1、人乳头瘤病毒(human papillomavirus，hpv)是一类双链环状dna病毒的总称，转性侵染和寄生于人生殖器官或其它组织器官的上皮细胞。hpv感染可造成生殖器疣或皮肤疣，且能诱发宫颈癌。据相关报道，几乎全部的宫颈鳞癌及超过85％的宫颈腺癌均由hpv感染所至。

2、目前研究发现，hpv存在上百种不同的亚型，且具有明显的地域分布特征。根据各亚型的致癌潜力，通常将hpv分为高危型和低危型两大类。低危型hpv通常可引起尖锐湿疣或宫颈上皮病变，极少引起宫颈癌。高危型hpv感染可引起男女外生殖器癌、高度子宫颈上皮内瘤变以及宫颈癌。大量研究证实，16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73及82共18种亚型为最常见的高危型hpv。

3、据此，本领域中存在着对高危型hpv进行全面检测的需求。目前已广泛应用是利用荧光定量pcr技术对hpv进行检测。遗憾的是，该技术通常无法进行准确的分型，不利于数据统计分析。此外，该类方法检测一个样本需要设置多个反应，对样本的质量有较高的要求。

4、利用高通量测序(ngs)可同时对多个样本进行hpv的精准分型，且对样本的质量需求较低。然而，ngs的有效测序长度通常在100bp左右，以至于目前成熟的多重pcr引物组合不能直接应用。

5、因此，开发出一种能特异性扩增18种高危型hpv的多重pcr引物组合，且能直接应用于ngs平台的技术体系，是本领域目前亟待解决的问题。

6、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种高危型人乳头瘤病毒的多重pcr检测试剂盒，通过该试剂盒能够同时检测18种高危型人乳头瘤病毒亚型。

2、本发明是这样实现的：

3、第一方面，本发明提供了一种检测人乳头瘤病毒的核酸组合物，其包括用于检测hpv16型、hpv18型、hpv26型、hpv31型、hpv33型、hpv35型、hpv39型、hpv45型、hpv51型、hpv52型、hpv53型、hpv56型、hpv58型、hpv59型、hpv66型、hpv68型、hpv73型和hpv82型的引物；

4、上述引物包括：用于检测hpv16/35型的上、下游引物，如seq id no:1-2所示；

5、用于检测hpv18/45型的上、下游引物，如seq id no:3-4所示；

6、用于检测hpv31型的上、下游引物，如seq id no:5-6所示；

7、用于检测hpv33/58型的上、下游引物，如seq id no:7-8所示；

8、用于检测hpv39/59/68型的上、下游引物，如seq id no:9-10所示；

9、用于检测hpv51/82型的上、下游引物，如seq id no:11-12所示；

10、用于检测hpv52/58型的上、下游引物，如seq id no:13-14所示；

11、用于检测hpv53/56/66型的上、下游引物，如seq id no:15-16所示；

12、用于检测hpv26型的上、下游引物，如seq id no:17-18所示；

13、用于检测hpv73型的上、下游引物，如seq id no:19-20所示。

14、上述核酸组合物由10对引物组成，其可应用于18种类型的hpv检测，其中的7对引物均是可以同时扩增2或3种亚型的。通过这种合并策略，本发明提供的核酸组合物相比于一对一扩增的引物组合，可以降低引物复杂度，避免引物过多造成的相互干扰，同时一定程度上降低了成本。

15、在一些实施例中，引物中dg修饰为8-oxo-dg，部分dt替换为du。

16、在本发明中，发明人对以上引物均进行了碱基修饰，经过修饰后的引物组合可以与目前市场上广泛使用的ngs建库试剂盒兼容，以便后续扩增产物进行高通量测序。

17、第二方面，本发明还提供了上述核酸组合物在制备检测人乳头瘤病毒的试剂盒中的应用。

18、本发明的核酸组合物主要是应用于目前最常见的18种hpv亚型：hpv16型、hpv18型、hpv26型、hpv31型、hpv33型、hpv35型、hpv39型、hpv45型、hpv51型、hpv52型、hpv53型、hpv56型、hpv58型、hpv59型、hpv66型、hpv68型、hpv73型和hpv82型的检测中。

19、第三方面，本发明还提供了一种检测人乳头瘤病毒的试剂盒，其包括上述核酸组合物。

20、在一些实施例中，检测体系中每条引物的终浓度为0.1μmol/l～0.5μmol/l。

21、在一些实施例中，检测体系还包括内参引物，其序列如seq id no:21-22所示，该内参基因为核糖核酸酶rpp30基因。

22、在一些实施例中，检测体系还包括2×platinum multiplex pcr master mix，其中含有dna聚合酶、dntps、mg2+、pcr缓冲液。

23、第四方面，本发明还提供了一种非诊断目的用于检测人乳头瘤病毒的方法，其包括：提取待测样品dna作为pcr反应模板，然后将pcr反应模板加入反应体系中进行多重pcr反应，再将扩增结果通过高通量测序并分析测序结果中的hpv信息，可获得样本的hpv基因型别。

24、在一些实施例中，反应体系为25μl：2×platinum multiplex pcr master mix12.5μl，上述的每条引物的终浓度为0.25μmol/l，模板dna 2μl，用无酶水补足至25μl。

25、本发明具有以下有益效果：

26、本发明的检测试剂盒可在全面覆盖18种高危型hpv的前提下，仅使用10对引物即可实现精准分型，可在单个反应完成样本的检测。扩增片段均在200bp以下，无需酶切等后续操作，可直接作为ngs建库的初始模板，适用于多种ngs平台。同时，由于结果判读是由测序仪完成，所以不易受个人主观因素影响，使结果更加准确，客观。

技术特征：

1.一种检测人乳头瘤病毒的核酸组合物，其特征在于，包括用于检测hpv16型、hpv18型、hpv26型、hpv31型、hpv33型、hpv35型、hpv39型、hpv45型、hpv51型、hpv52型、hpv53型、hpv56型、hpv58型、hpv59型、hpv66型、hpv68型、hpv73型和hpv82型的引物；

2.根据权利要求1所述的核酸组合物，其特征在于，所述引物中dg修饰为8-oxo-dg，部分dt替换为du。

3.权利要求1或2所述的核酸组合物在制备检测人乳头瘤病毒的试剂盒中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用包括对人乳头瘤病毒的hpv16型、hpv18型、hpv26型、hpv31型、hpv33型、hpv35型、hpv39型、hpv45型、hpv51型、hpv52型、hpv53型、hpv56型、hpv58型、hpv59型、hpv66型、hpv68型、hpv73型和hpv82型进行检测。

5.一种检测人乳头瘤病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的核酸组合物。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述检测体系中每条引物的终浓度为0.1μmol/l～0.5μmol/l。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述检测体系还包括内参引物，其序列如seq id no:21-22所示。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述检测体系还包括2×platinummultiplex pcr master mix，其中含有dna聚合酶、dntps、mg2+、pcr缓冲液。

9.一种非诊断目的用于检测人乳头瘤病毒的方法，其特征在于，包括：取样本提取dna作为pcr反应模板，然后将pcr反应模板加入反应体系中进行多重pcr反应，再将扩增结果通过高通量测序并分析测序结果中的hpv信息，可获得样本的hpv基因型别。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述反应体系为25μl：2×platinummultiplex pcr master mix 12.5μl，权利要求1或2所述的每条引物的终浓度为0.25μmol/l，模板dna 2μl，用无酶水补足至25μl。

技术总结本发明公开了一种高危型人乳头瘤病毒的多重PCR检测试剂盒。该检测试剂盒可在全面覆盖18种高危型HPV(HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82)的前提下，仅使用10对引物即可实现精准分型，可在单个反应完成样本的检测，并且适用于多种NGS平台。同时，由于结果判读是由测序仪完成，所以不易受个人主观因素影响，使结果更加准确，客观。技术研发人员：戴鹏高,刘金辉,马军,王奇,颜桦受保护的技术使用者：陕西佰美基因股份有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/13