一组在酵母中表达蛋白、用于双分子荧光互补实验的载体系统及其应用

本发明属于生物，具体涉及一组在酵母中表达蛋白、用于双分子荧光互补实验的载体系统及其应用。

背景技术：

1、酵母双杂交、免疫共沉淀、双分子荧光互补、荧光能量转移共振、荧光素酶互补和蛋白质下拉等实验是目前实现蛋白质互作分析的主要途径，以此有利于实现对目的基因的功能分析。

2、植物中常规的双分子荧光互补(bifc)实验一般是将两个互作基因分别构建在融合有nyfp和cyfp的载体后，进行农杆菌注射烟草表皮细胞或转化原生质体，之后根据转化后表皮细胞或原生质体内部是否存在荧光信号来确定是否基因对在体内存在互作，而上述方案中如需要添加细胞器marker，则需要在转化体系中混合额外的农杆菌或质粒，该过程对目的基因对的互作有一定潜在影响，同时会降低转化的成功率。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一组在酵母中表达蛋白、用于双分子荧光互补实验的载体系统及其应用，利用酵母细胞繁殖快，细胞重复性好的特性，能够在细胞体内进行互作基因对bifc实验的同时，提供细胞器marker信息进行共定位，结果准确真实。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明提供了一组在酵母中表达的载体，所述载体包括第一载体和第二载体；所述第一载体包括编码荧光蛋白n端残基的核苷酸序列和第一基础载体；所述第二载体包括编码荧光蛋白c端残基的核苷酸序列和第二基础载体；所述荧光蛋白n端残基和荧光蛋白c端残基组成完整的荧光蛋白；所述第一基础载体和第二基础载体包括能够在酵母中表达的载体。

4、优选的，所述荧光蛋白包括黄色荧光蛋白yfp；所述荧光蛋白n端残基包括nyfp；所述荧光蛋白c端残基包括cyfp。

5、优选的，所述第一载体包括pgbk-nyfp；所述第二载体包括pgad-cyfp。

6、本发明提供了用于构建上述技术方案所述载体的引物组，包括：pgad-cyfp-f、pgad-cyfp-r、pgbkt7-donor-f、pgbkt7-donor-r、pgbk-nyfp-f、和pgbk-gfp-r；所述pgad-cyfp-f的核苷酸序列如seq id no.13所示；所述pgad-cyfp-r的核苷酸序列如seq idno.14所示；所述pgbkt7-donor-f的核苷酸序列如seq id no.21所示；所述pgbkt7-donor-r的核苷酸序列如seq id no.22所示；所述pgbk-nyfp-f的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述pgbk-nyfp-r的核苷酸序列如seq id no.2所示。

7、本发明提供了一种双分子荧光互补定位系统，包括上述技术方案所述载体或所述引物组构建的载体，以及含有酵母细胞器marker基因的重组质粒pgad-marker-red。

8、优选的，所述酵母细胞器marker基因包括：elo3基因、anp1基因、cox4基因、pex3基因、nab2基因、chs5基因、vhc1基因、vps4基因、tgl3基因、ccr4基因、pho5基因和ybl029c-a基因中的一种或多种。

9、优选的，所述重组质粒pgad-marker-red包括：pgad-elo3-red质粒、pgad-anp1-red质粒、pgad-cox4-red质粒、pgad-pex3-red质粒、pgad-nab2-red质粒、pgad-chs5-red质粒、pgad-vhc1-red质粒、pgad-vps4-red质粒、pgad-tgl3-red质粒、pgad-ccr4-red质粒、pgad-pho5-red质粒和pgad-ybl029c-a-red中的一种或多种。

10、本发明提供了上述技术方案所述的载体、所述的引物组或所述的双分子荧光互补定位系统在基因对互作定位中的应用。

11、本发明提供了一种基于酵母体系检测基因对互作定位的方法，包括如下步骤：待测基因b重组至pgad-cyfp中，得到pgad-待测基因b-cyfp；将待测基因a重组至pgbk-nyfp中，得到pgbk-待测基因a-nyfp；将所述pgad-待测基因b-cyfp和pgbk-待测基因a-nyfp的表达盒重组至pgad-marker-red载体中，得到含有三个表达盒的重组质粒；将所述重组质粒共转染至酵母中进行培养，并对培养物进行发光检测；当所述培养物发光时，则说明培养物在marker基因对应的细胞器中发生互作；所述marker基因包括：elo3基因、anp1基因、cox4基因、pex3基因、nab2基因、chs5基因、vhc1基因、vps4基因、tgl3基因、ccr4基因、pho5基因或ybl029c-a基因。

12、有益效果：

13、本发明提供了一组在酵母中表达的载体，所述载体包括第一载体和第二载体；所述第一载体包括编码荧光蛋白n端残基的核苷酸序列和第一基础载体；所述第二载体包括编码荧光蛋白c端残基的核苷酸序列和第二基础载体；所述荧光蛋白n端残基和荧光蛋白c端残基组成完整的荧光蛋白；所述第一基础载体和第二基础载体包括能够在酵母中表达的载体。通过将能够进行组装的荧光蛋白分别与能够在酵母中表达的基础载体进行重组并构建成对应的载体，有利于得到特异性且高效在酵母中表达的载体，为实现互作基因对的高效检测提供载体工具。

14、基于上述优势，本发明进一步提供了一种双分子荧光互补定位系统及其在基因互作定位中的应用。本发明通过将待测基因对分别重组至第一载体和第二载体中并转化酵母细胞，能够实现体内双分子荧光互补实验；同时，将两个含有待测基因的表达盒重组于细胞器marker质粒中，可在实现bifc的基础上，确定待测基因在体内互作的位置，操作更为便捷。实验证明，采用本发明提供的技术方案后，互作基因对在实现体内bifc实验的同时，还能进行定位且结果更加详细，准确，真实。

技术特征：

1.一组在酵母中表达的载体，其特征在于，所述载体包括第一载体和第二载体；

2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述荧光蛋白包括黄色荧光蛋白yfp；所述荧光蛋白n端残基包括nyfp；所述荧光蛋白c端残基包括cyfp。

3.根据权利要求1或2所述的载体，其特征在于，所述第一载体包括pgbk-nyfp；所述第二载体包括pgad-cyfp。

4.用于构建权利要求1～3任一项所述载体的引物组，其特征在于，包括：pgad-cyfp-f、pgad-cyfp-r、pgbkt7-donor-f、pgbkt7-donor-r、pgbk-nyfp-f、和pgbk-gfp-r；

5.一种双分子荧光互补定位系统，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述载体或权利要求4所述引物组构建的载体，以及含有酵母细胞器marker基因的重组质粒pgad-marker-red。

6.根据权利要求5所述的双分子荧光互补定位系统，其特征在于，所述酵母细胞器marker基因包括：elo3基因、anp1基因、cox4基因、pex3基因、nab2基因、chs5基因、vhc1基因、vps4基因、tgl3基因、ccr4基因、pho5基因和ybl029c-a基因中的一种或多种。

7.根据权利要求5所述的双分子荧光互补定位系统，其特征在于，所述重组质粒pgad-marker-red包括：pgad-elo3-red质粒、pgad-anp1-red质粒、pgad-cox4-red质粒、pgad-pex3-red质粒、pgad-nab2-red质粒、pgad-chs5-red质粒、pgad-vhc1-red质粒、pgad-vps4-red质粒、pgad-tgl3-red质粒、pgad-ccr4-red质粒、pgad-pho5-red质粒和pgad-ybl029c-a-red中的一种或多种。

8.权利要求1～3任一项所述的载体、权利要求4所述的引物组或权利要求5～7任一项所述的双分子荧光互补定位系统在基因对互作定位中的应用。

9.一种基于酵母体系检测基因对互作定位的方法，其特征在于，包括如下步骤：

技术总结本发明属于生物技术领域，具体涉及一组在酵母中表达蛋白、用于双分子荧光互补实验的载体系统及其应用。本发明通过将能够进行组装的荧光蛋白分别与能够在酵母中表达的基础载体进行重组并构建成对应的载体，有利于得到特异性且高效在酵母中表达的载体，为实现互作基因对的高效检测提供载体工具。基于上述优势，本发明进一步提供了一种双分子荧光互补定位系统及其在基因互作定位中的应用，以此不仅能够实现互作基因对的体内BiFC实验，还能进行定位且结果准确真实。技术研发人员：马益赞,闵玲,朱龙付,张献龙受保护的技术使用者：华中农业大学技术研发日：技术公布日：2024/6/13