西瓜低氮耐受性相关KASP分子标记及其用途

本发明属于蔬菜农艺性状分子标记开发和分子标记辅助育种，具体适用于西瓜低氮耐受性的快速筛选和分子标记辅助育种，提供一种新型且简便的分子标记及辅助选择方法。

背景技术：

1、随着世界人口的迅速增长和人民生活水平的不断提高，人类对农产品的需求量也不断增加。为提高作物产量，人们通过施用大量肥料促进植物生长发育，进而导致肥料施用量逐年增加。据统计，1980年至2013年，我国氮肥施用量增加约1.6倍，而粮食产量仅增加了87% (http://data.stats.gov.cn/)。氮肥的大量施用和作物氮素利用效率低的问题不仅增加了农业生产成本，还导致了土壤酸化、水体富营养化等环境问题 (蒋志敏, 王威, 储成才 (2018) 植物氮高效利用研究进展和展望. 生命科学30: 1060-1071)。因此减少氮肥施用量、培育耐低氮的农作物新品种是解决这一问题的主要手段。

2、自然土壤氮素匮乏，植物已经进化出多种机制适应低氮胁迫 (kiba t, krapp a(2016) plant nitrogen acquisition under low availability: regulation ofuptake and root architecture. plant cell physiol 57:707-714)，如根系中转运蛋白吸收活性的增加、改变根系结构以增加对氮素的吸收、老叶中氮素的再利用等 (nacry p,bouguyon e, gojon a (2013) nitrogen acquisition by roots: physiological anddevelopmental mechanisms ensuring plant adaptation to a fluctuating resource.plant soil 370:1-29)。atclc-b可促进硝酸盐外排，提高拟南芥低氮适应性 (shi y, liud, he y, tang j, chen h, gong p, luo js, zhang z (2023) chloride channel-bmediates vacuolar nitrate efflux to improve low nitrogen adaptation inarabidopsis. plant physiol 193:1987-2002)。在低氮条件下，通常根系中高亲和转运蛋白家族nrt2发挥作用 (liu x, huang d, tao j, miller aj, fan x, xu g (2015)identification and functional assay of the interaction motifs in the partnerprotein osnar2.1 of the two-component system for high-affinity nitratetransport. new phytol 204)。atnrt2.1在拟南芥氮缺乏情况下发挥主要作用，负责质外体硝酸盐的吸收，定位于初生根、侧根的表皮细胞 (wirth j, chopin f, santoni v,viennois g, tillard p, krapp a, lejay l, daniel-vedele f, gojon a (2007)regulation of root nitrate uptake at the nrt2.1 protein level in arabidopsisthaliana. journal of biological chemistry 282:23541-23552)。atnrt2.4和atnrt2.5在低氮情况下表达量上升来响应低氮胁迫(lezhneva l, kiba t, feria-bourrellierab, lafouge f, boutet-mercey s, zoufan p, sakakibara h, daniel-vedele f,krapp a (2014) the arabidopsis nitrate transporter nrt2.5 plays a role innitrate acquisition and remobilization in nitrogen-starved plants. plant j80:230-241)。水稻中nac类转录因子osnap参与调控叶片衰老过程，低氮胁迫下osnap过量表达可使籽粒中总氮含量明显升高，剑叶中氮等营养元素的含量降低，从而促进叶片衰老(liang cz, wang yq, zhu yn, tang jy, hu b, liu lc, ou sj, wu hk, sun xh, chujf, chu cc (2014) osnap connects abscisic acid and leaf senescence by fine-tuning abscisic acid biosynthesis and directly targeting senescence-associated genes in rice. proc natl acad sci u s a 111:10013-10018)。ostcp19可决定不同水稻品种在低氮水平下的分蘖数进而影响水稻产量 (liu y, wang h, jiang z,wang w, xu r, wang q, zhang z, li a, liang y, ou s, liu x, cao s, tong h,wang y, zhou f, liao h, hu b, chu c (2021) genomic basis of geographicaladaptation to soil nitrogen in rice. nature 590:600-605)。

3、西瓜（citrullus lanatus (thunb.) matsum. & nakai）是需肥较多的高产经济作物，氮肥则是西瓜优质、高产的基础。目前，在农业生产中西瓜氮肥施用量高、氮肥利用率低等问题突出，而决定西瓜低氮耐受性的关键靶标基因未被克隆，西瓜低氮耐受性相关功能性分子标记也未在育种过程中得以应用。因此，鉴定调控西瓜低氮耐受性的关键基因，并开发西瓜低氮耐受性相关的功能性分子标记，可加速西瓜“绿色”新品种的分子设计育种。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供一种与西瓜低氮耐受性性状紧密连锁的分子标记，开发了西瓜低氮耐受性相关的kasp分子标记及其用途，本发明所获得的分子标记可用于耐低氮西瓜育种材料的筛选鉴定和分子标记辅助选择育种。

2、本发明第一方面，提供了一种西瓜低氮耐受性相关基因clsik1：所述基因的核苷酸序列如seq id no: 1所示。

3、本发明第二方面，还同时提供了上述西瓜低氮耐受性相关基因clsik1编码的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列如seq id no: 2所示。

4、本发明第三方面，还同时提供了一种西瓜低氮耐受性相关kasp分子标记，所述分子标记位于西瓜低氮耐受性相关基因clsik1的第一个外显子625 bp处；所述西瓜低氮耐受性相关基因clsik1的核苷酸序列如seq id no: 1所示；所述分子标记的基因型从g突变为t，t基因型对应表型为耐低氮型，g基因型对应表型为低氮敏感型。

5、本发明第四方面，还同时提供了检测所述的西瓜低氮耐受性相关kasp分子标记的试剂在鉴定不同低氮耐受性的西瓜材料及其后代的分子辅助选择育种中的用途。

6、进一步地，检测所述的西瓜低氮耐受性相关kasp分子标记的试剂包括下列引物对：

7、正向引物f-fam（seq id no.3）：

8、5’-gaaggtgaccaagttcatgctcggtcgcgagtatgcaag-3’

9、正向引物f-hex（seq id no.4）：

10、5’-gaaggtcggagtcaacggattcggtcgcgagtatgcaat-3’

11、反向引物r（seq id no.5）：

12、5’-cgtatccgaccaccgcctt-3’

13、引物（分子标记）可委托上海生工生物工程股份有限公司合成，在abi step onepcr仪上进行扩增。

14、进一步地，具体为：

15、（1）提取待测西瓜样本基因组dna；

16、（2）利用检测所述的西瓜低氮耐受性相关kasp分子标记的试剂对待测西瓜样本基因组dna进行pcr扩增；

17、（3）检测pcr扩增结果的荧光信号判断待测西瓜低氮耐受性，其中，若pcr扩增结果荧光信号颜色与正向引物f-hex的荧光接头颜色一致，则待测西瓜为纯合基因型tt，表型为耐低氮型，若pcr扩增结果荧光信号颜色与正向引物f-fam的荧光接头颜色一致，则待测西瓜为纯合基因型“gg”，表型为低氮敏感型；若pcr扩增结果荧光信号颜色均与正向引物f-fam、正向引物f-hex的荧光接头颜色不同，则为杂合基因型。

18、进一步地，所述步骤（2）中，pcr扩增使用的pcr反应体系为：20-50 ng/μl西瓜基因组dna 5.0 μl，kasp master mix 5.0 μl，kasp assay mix 0.14 μl，总体积为10.14 μl；kasp assay mix 中包含正向引物f-fam、正向引物f-hex和反向引物r，且正向引物f-fam、正向引物f-hex、反向引物r的体积比为2:2:5，三种引物浓度均为10 ng/μl。

19、进一步地，所述步骤（2）中，pcr扩增使用的pcr反应程序为：30 ℃，1 min读取荧光信号；94 ℃，15 min预变性；94 ℃，20 s变性；61 ℃退火60 s，10个循环，每次循环后都下降0.6 ℃；94 ℃，20 s变性；55 ℃，退火60 s，31个循环；30 ℃，1 min读取荧光信号。

20、本发明第五方面，还提供了上述分子标记的开发方法，包括以下步骤：

21、（1）调查西瓜自然群体材料的低氮耐受性；

22、（2）用ctab（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyl trimethyl ammonium bromide）法提取西瓜自然群体基因组dna；

23、（3）完成西瓜自然群体材料的重测序，随后进行gwas分析（全基因组关联分析，genome-wide association study）定位与西瓜低氮耐受性相关的区域或基因；

24、（4）鉴定与西瓜低氮耐受性紧密连锁的snp变异和indel插入缺失变异；

25、（5）基于连锁的变异，采用kasp（竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应，kompetitive allele specific polymerase chain reaction）方法进行西瓜低氮耐受性相关分子标记的筛选；

26、（6）开发出一个与西瓜低氮耐受性性状紧密连锁的kasp分子标记。

27、说明：在本发明中，表1所述的西瓜品种，按照上述pcr反应程序均能实现充分分型。

28、本发明第六方面，还提供了一种鉴定西瓜氮素吸收效率的方法，具体为：

29、（1）提取待测西瓜样本基因组dna；

30、（2）利用检测所述的西瓜低氮耐受性相关kasp分子标记的试剂对待测西瓜样本基因组dna进行pcr扩增；所述检测所述的西瓜低氮耐受性相关kasp分子标记的试剂包括下列引物对：

31、正向引物f-fam：

32、5’-gaaggtgaccaagttcatgctcggtcgcgagtatgcaag-3’

33、正向引物f-hex：

34、5’-gaaggtcggagtcaacggattcggtcgcgagtatgcaat-3’

35、反向引物r：

36、5’-cgtatccgaccaccgcctt-3’；

37、（3）检测pcr扩增结果的荧光信号判断待测西瓜低氮耐受性，其中，若pcr扩增结果荧光信号颜色与正向引物f-hex的荧光接头颜色一致，则待测西瓜为纯合基因型tt，表型为耐低氮型，若pcr扩增结果荧光信号颜色与正向引物f-fam的荧光接头颜色一致，则待测西瓜为纯合基因型“gg”，表型为低氮敏感型；若pcr扩增结果荧光信号颜色均与正向引物f-fam、正向引物f-hex的荧光接头颜色不同，则为杂合基因型。

38、本发明的有益效果是：设计开发的与低氮耐受性紧密连锁的kasp分子标记，可以进行西瓜低氮耐受性品种的初步筛选。在西瓜耐低氮性状的选择育种过程中，往往会产生大量的分离群体，采用该分子标记，可快速选择出分离群体中耐低氮的单株用于育种改良，实现西瓜植株氮素的高效利用，加速“绿色”西瓜品种的分子育种进程。