一种重组人源角蛋白的分离纯化方法与流程

本发明属于角蛋白分离纯化，具体涉及一种重组人源角蛋白k31全长序列的分离纯化方法。

背景技术：

1、角蛋白(keratin)属于中间纤维蛋白(intermediateprotein，ip)家族，是构成头发、角、爪和人体皮肤外层的主要蛋白质，其具有较高含量的半胱氨酸，并能与邻近的蛋白质或多肽链通过二硫键进行交联，进而形成稳固的纤维结构，具有一定的机械性能，可以保护上皮组织细胞免受损伤或压力。同时，半胱氨酸的交联是角蛋白的主要交联结构，角蛋白的物理和化学性质主要与该交联结构相关，角蛋白具有较高的疏水性，一般不溶于水、盐液、稀酸或稀碱，严重限制了天然角蛋白材料的开发和利用。

2、人类头发中有两种角蛋白复合物，分别称为i型(酸性)角蛋白和ⅱ型(碱性)角蛋白，i型角蛋白分为10组，即角蛋白k31-k40，分子量在46至55之间kda，含有大量半胱氨酸和脯氨酸残基。ii型角蛋白分为6组，角蛋白k81-k86，分子量在54至57之间kda。i型和ii型角蛋白表达后组装形成异二聚体螺旋，二聚体螺旋又会反复交联形成四聚体，如此循环直至形成10nm盘绕线圈结构的中间丝蛋白。因此，人发角蛋白具有难分解、溶解性低等特点。

3、角蛋白k31是一种i型酸性角蛋白，是人类头发角蛋白复合体的主要蛋白质，对保持头发的拉伸强度至关重要。k31与其余i型头发角蛋白具有最大同源性，从而使其能够有效地与受损头发中的伴侣蛋白结合。完整的蛋白质在恢复或提高受损头发纤维的机械强度方面具有重要意义。目前角蛋白多为以动物毛发为原料提取，对人来说属于异源蛋白，被使用可能会引起人的过敏反应，有一定的安全性问题。因此，开发一种可溶性人源完整角蛋白的提取方法，从而获得能直接被生物吸收利用、发挥完整生物学功能、使用安全的人源角蛋白十分重要。

4、专利文献cn110117323a公开了一种可溶性人源角蛋白及其应用，该可溶性人源角蛋白采用亲和层析纯化蛋白，依次用含有10mm、20mm、50mm、100mm、200mm、300mm和500mm咪唑的变性buffer进行阶段洗脱，收集洗脱蛋白液，以透析液(25mm tris ph＝8.0，10mm咪唑，20mmβ-巯基乙醇，20mm半胱氨酸，余量为去离子水)脱盐换缓冲。但是，该方法以透析液(20mmβ-巯基乙醇，20mm半胱氨酸，余量为去离子水)透析脱盐，透析时间为12h，耗时较长。

5、专利文献cn112646045a公开了一种重组角蛋白分离纯化方法，包括：1)将表达重组角蛋白的大肠杆菌进行发酵，再将发酵后的大肠杆菌菌液离心获得菌泥，再将菌泥溶解于缓冲液后进行高压匀浆后进行离心收集上清液，最后对上清液用0.22um中空纤维对上清液进行过滤得到含有重组角蛋白的滤液；2)采用ni亲和层析柱对步骤1)中得到含有重组角蛋白的滤液进行分离，收集含重组角蛋白的洗脱缓冲液；3)采用阴离子层析柱对步骤2)得到的含重组角蛋白的洗脱缓冲液进行二次分离，收集二次洗脱缓冲液。但是，该方法不能得到复性可溶的角蛋白溶液，严重限制了其应用。

6、阚金兰发表了题目为《基于重组蛋白的人发角蛋白提取机制初探及组织修复应用》的论文，该论文中离心获得的包涵体沉淀用蒸馏水透析，将上清液装入截留量为10kda的透析袋中，置于4℃环境下，用蒸馏水(透析液体积>上清液体积的40倍)透析。透析期间每隔4小试更换一次透析液，充分透析后，离心取上清。但是，该方法产率较低，而且工艺复杂，耗时漫长，不利于用于工业商品生产。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中的不足，本发明提供了一种重组人源角蛋白k31全长序列的分离纯化方法。该分离纯化方法是一种由大肠杆菌表达纯化获得高纯度全长重组人源角蛋白的方法，经过基因合成、载体构建、iptg诱导表达、包涵体富集、包涵体清洗、亲和层析、柱上复性、蛋白洗脱等步骤，可以获得高纯度、高回收率、结构完整的重组人源角蛋白。

2、本发明提供了一种重组人源角蛋白的分离纯化方法，包括以下步骤：

3、s1：将表达重组角蛋白的大肠杆菌发酵后的大肠杆菌菌液在4000g、温度为4℃的条件下离心30min，得菌泥，再将菌泥进行裂解，离心收集沉淀，洗涤，离心收集沉淀，溶解，离心收集上清液，上清液使用0.45um滤膜过滤，得k31角蛋白包涵体上清液；

4、s2：采用ni亲和层析柱对步骤s1得到的k31角蛋白包涵体上清液进行分离，所述亲和层析的处理条件为：2cv纯净水处理层析柱，5～10cv平衡缓冲液平衡层析柱，5～10cv平衡缓冲液清洗杂质，20～30cv复性缓冲液进行复性，10～20cv洗脱缓冲液进行洗脱，收集含重组角蛋白的洗脱缓冲液；

5、s3：将步骤s2得到的含重组角蛋白的洗脱缓冲液进行溶液置换，加入冻干保护剂，冻干，即得。

6、进一步地，所述步骤s1中菌泥的裂解、洗涤和溶解处理步骤为：将菌泥溶解于非变性缓冲液，液氮-37℃反复冻融裂解2～3次，离心去除上清液，得包涵体沉淀；接着使用洗涤缓冲液洗涤包涵体沉淀，离心去除上清液，得洗涤后包涵体沉淀；接着使用变性缓冲液溶解洗涤后包涵体沉淀，在温度为4～37℃，转速为150rpm的条件下摇床孵育0.5～1h，离心收集上清液。

7、进一步地，所述非变性缓冲液的添加量是菌泥体积的5～10倍，所述非变性缓冲液为20mmol/ltris-hcl、150mmol/lnacl、5mmol/l edta，ph8.0；所述洗涤缓冲液的添加量是菌泥体积的5～10倍，所述洗涤缓冲液为20mmol/ltris-hcl、2mol/l nacl，ph8.0；所述变性缓冲液的添加量是菌泥体积的5～10倍，所述变性缓冲液为20mmol/ltris-hcl、150mmol/lnacl、6～8mol/l尿素、5％甘油，ph8.0。

8、进一步地，所述步骤s1中离心条件为：在转速为10000～12000rpm，温度为4℃的条件下离心10min。

9、进一步地，所述步骤s2中亲和层析的具体步骤为：

10、a：清洗，使用2cv纯净水将填料洗净；

11、b：平衡，使用5～10cv平衡缓冲液平衡填料，流速为44.76cm/h；

12、c：上样，将样品流加至层析柱中，流速为44.76cm/h，收集流穿样品，记ft；

13、d：洗杂，使用平衡缓冲液清洗层析柱5～10cv，流速为44.76cm/h，收集洗杂样品，记wash；

14、e：复性，采用重力柱复性或预装柱复性，使用20～30cv复性缓冲液进行复性，流速为44.76cm/h，收集流出记复性；

15、f：洗脱，使用洗脱缓冲液洗5～10cv，流速为44.76cm/h，收集洗脱样品，记xt。

16、进一步地，所述步骤s2中的平衡缓冲液为：20mmol/l tris-hcl、150～500mmol/lnacl、8mol/l尿素、5％甘油，ph8.0。

17、进一步地，所述步骤s2中的复性缓冲液由复性缓冲液a组、复性缓冲液b组和复性缓冲液c组组成：

18、所述复性缓冲液a组：

19、复性缓冲液①：20mmol/l tris-hcl、150～500mmol/l nacl、5％甘油、1mmol/l还原型谷胱甘肽、0.1mmol/l氧化型谷胱甘肽，ph8.0；

20、复性缓冲液②：20mmol/ltris-hcl、150～500mmol/lnacl、6mol/l尿素、5％甘油、1mmol/l还原型谷胱甘肽、0.1mmol/l氧化型谷胱甘肽，ph8.0；

21、所述复性缓冲液b组：

22、复性缓冲液①：20mmol/l tris-hcl、150～500mmol/lnacl、5％甘油、0.6mol/l精氨酸，ph8.0；

23、复性缓冲液②：20mmol/ltris-hcl、150～500mmol/lnacl、6mol/l尿素、5％甘油、0.6mol/l精氨酸，ph8.0；

24、所述复性缓冲液c组：

25、复性缓冲液①：20mmol/ltris-hcl、150～500mmol/lnacl、5％甘油、1mmol/lβ巯基乙醇、1mmol/ledta，ph8.0；

26、复性缓冲液②：20mmol/ltris-hcl、150～500mmol/lnacl、6mol/l尿素、5％甘油、1mmol/lβ巯基乙醇、1mmol/l edta，ph8.0。

27、进一步地，所述步骤s2还包括复性阶段掉落蛋白的复性步骤：所述复性缓冲液采用复性缓冲液a组中的复性缓冲液①：20mmol/l tris-hcl、150～500mmol/lnacl、5％甘油、1mmol/l还原型谷胱甘肽、0.1mmol/l氧化型谷胱甘肽，ph8.0；缓慢稀释5～30倍，在温度为4℃的条件下静置2～5h进行完全复性。

28、进一步地，所述步骤s2中的洗脱缓冲液为：20mmol/ltris-hcl、150mmol/lnacl、0～500mmol/l咪唑、5％甘油，ph8.0。

29、进一步地，所述步骤s3中的冻干保护剂为2％蔗糖+2％甘露糖或2％蔗糖+2％精氨酸。

30、本发明提供的重组人源角蛋白k31的分离纯化方法包括：(1)重组人源角蛋白细菌菌株、载体构建；(2)重组人角蛋白大肠杆菌发酵及诱导表达；(3)重组人源角蛋白包涵体提取及清洗；(4)重组人源角蛋白亲和层析上样；(5)柱上复性及洗脱，可以利用重力柱进行重组人源角蛋白柱上复性及洗脱或利用预装柱进行重组人源角蛋白柱上复性及洗脱；(6)添加冻干保护剂对重组人源角蛋白进行冻干保护，最终获得高纯度、高回收率、结构完整的重组人源角蛋白k31。

31、本发明经过大量的摸索实验，优选出了合适的重组人源角蛋白k31包涵体的清洗工艺，先采用由20mmol/ltris-hcl、150mmol/lnacl、5mmol/l edta，ph8.0组成的非变性缓冲液进行裂解，接着加入由20mmol/ltris-hcl、2mol/lnacl，ph8.0组成的洗涤缓冲液进行洗涤，最后加入由20mmol/ltris-hcl、150mmol/lnacl、6～8mol/l尿素、5％甘油，ph8.0组成的变性缓冲液变性溶解。该清洗工艺可以有效地降低杂蛋白含量，降低k31蛋白的损耗，同时还可以降低上清液的粘性，有利于降低纯化难度，提高k31蛋白的纯度。

32、目前，包涵体的复性过程仍是依赖经验，没有通用的方法可以套用。变性剂的选择因不同的蛋白质而异。本发明创造性地提出了包涵体重组人源角蛋白的重力柱上复性方法：使用复性缓冲液降6mol/l尿素洗至0mol/l尿素，6mol/l-5mol/l-4mol/l-3mol/l-2mol/l-1mol/l-0mol/l，每个梯度洗4cv，流速为44.76cm/h，可以获得较高纯度的重组人源胶蛋白。本发明提供的复性方法可以使得k31变性蛋白柱上复性后蛋白纯度可达90％以上，复性过程中未折叠完全掉落蛋白可通过稀释复性回收，蛋白纯度可达95％以上，k31变性蛋白柱上复性后蛋白回收率60％以上，高于常规稀释复性及透析法，有利于节省操作时间，获得结构完整的k31蛋白。

33、此外，为了更好地保护重组人源角蛋白在冻干过程中的活性物质，防止其结构和功能受损，本发明优选出特定的冻干剂，可以更好地保护重组人源角蛋白的活性，防止结构和功能受损，提高重组人源角蛋冻干粉白的品质。

34、与现有技术相比，本发明提供的重组人源角蛋白的分离纯化方法具有以下优点：

35、(1)本发明提供的重组人源角蛋白的分离纯化方法可以有效降低变性包涵体上清液的粘性和杂蛋白含量，减少目的蛋白的损耗，有利于降低纯化难度，提高蛋白质产率。

36、(2)本发明提供的重组人源角蛋白的分离纯化方法复性后蛋白质纯度可达90％以上；复性过程中未折叠完全掉落蛋白可通过稀释复性回收，蛋白纯度可达95％以上，可以获得结构完整的k31蛋白。

37、(3)本发明提供的重组人源角蛋白的分离纯化方法柱上复性后蛋白回收率可达60％以上，高于常规稀释复性及透析法，更有利于节省操作时间。

38、为更好理解本发明，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。

39、术语“cv”指层析柱体积。