一种检测副流感病毒5型的LAMP引物组、试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及一种检测副流感病毒5型的lamp引物组、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、副流感病毒5型（parainfluenza virus 5，piv5）为单股负链不分节段的rna病毒，属于副黏病毒科(paramyxoviridae)副黏病毒亚科(paramyxovirinae)腮腺炎病毒属(rubula-virus)，可引起穿山甲、犬、猫、猪、牛、仓鼠、豚鼠等多种动物及人呼吸道感染。piv5病毒粒子直径为150~200 nm，通常呈圆形。piv5可感染包括人类细胞在内的多种细胞，且在大多数细胞中均可获得高滴度的病毒，其中以非洲绿猴肾细胞(vero细胞)更敏感。

2、piv5基因组大小为15246 nt，在副黏病毒科病毒中最小，遵循“六碱基原则”，其结构式为3 '-np-v/p-m-f- (sh) -hn-l-5'，其中两侧为3 '端非编码区 (即前导序列，leader sequence)和5'端非编码区(即尾随序列，trailer sequence)，各基因编码产生蛋白分别为核衣壳蛋白 (neucleocapsid protein，np)、磷酸化蛋白 (phosphoprotein，p)、v蛋白 (v protein，v)、膜基质蛋白 (matrix protein，m)、小疏水性蛋白 (smallhydrophobic protein，sh)、血凝素-神经氨酸酶 (hemagglutinin-neuraminidase，hn)、聚合酶蛋白 (largepolymerase protein，l)。其中np、p、l三种蛋白为piv5病毒粒子的重要组成部分，为核衣壳的装配和指导病毒转录复制所必须，相互结合可形成核糖核蛋白体。np蛋白可以直接与病毒rna相结合，且具有很高的保守性，是构成核衣壳蛋白的主要成分之一，也是核衣壳蛋白组装所必需的蛋白之一。np蛋白含有高度保守的中间区域f-x4-y-x3-ψ-s-ψ-a-m-a（x指任意氨基酸残基，ψ指芳香族氨基酸），该区域与n-n自我组装以及n-rna的相互作用有关。此外，由于np基因的极高保守性，因此其常作为pcr检测该病毒的靶基因。

3、目前piv5型病毒检测通常采用常规pcr方法，该方法需要使用昂贵的pcr仪器设备等，而且其操作流程较复杂，往往需要实验人员具备一定的实验技能，不适合基层生产或现场快速诊断。

4、环介导等温扩增法(loop mediated isothermal amplification，lamp)是利用一种具有链置换活性的核酸扩增酶-bst dna聚合酶，在等温条件下进行核酸的变性和自动循环的链置换核酸扩增反应。lamp针对靶序列的6个区域设计4条特异引物，利用具备链置换功能的dna聚合酶在恒定温度下不断复制扩增dna。为了提高反应效率，可在反应体系中添加两条环引物，使之分别与茎环结构结合，启动链置换合成，循环复制。执行lamp检测只需要一个恒温模块，避免了pcr的热循环需求。lamp检测技术具有高灵敏度、特异性、便利性和高效率的特征，已被广泛用于病原体诊断。

5、综上，开发基于环介导等温扩增piv5的检测引物组、试剂盒及相应的检测方法在本领域具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种快速、高效、便捷、低成本、易操作的检测副流感病毒5型的lamp引物组、试剂盒及其应用。

2、本发明的第一个目的是提供一种检测副流感病毒5型的lamp引物组，包括一对外引物f3和b3以及一对内引物fip和bip；所述的外引物f3，其核酸序列如seq id no.1所示；所述的外引物b3，其核酸序列如seq id no.2所示；所述的内引物fip，其核酸序列如seq idno.3所示；所述的内引物bip，其核酸序列如seq id no.4所示。

3、本发明的第二个目的是提供一种检测副流感病毒5型的试剂盒，其包括环介导等温扩增试剂和所述的检测副流感病毒5型的lamp引物组。

4、优选，所述的环介导等温扩增试剂包括bst 3.0 dna polymerase、10×isothermal amplification buffer ii、dntp mix、betaine和mgso4。

5、优选，所述的检测副流感病毒5型的lamp引物组中，外引物f3和b3的浓度为10 μm，内引物fip和bip的浓度为40 μm。

6、优选，所述的检测副流感病毒5型的试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品，所述的阳性对照品为含有副流感病毒5型np基因的重组质粒，所述的阴性对照品为depc处理的ddh2o。

7、本发明的第三个目的是提供所述的检测副流感病毒5型的lamp引物组在检测副流感病毒5型中的应用。

8、优选，所述的应用，包括以下步骤：

9、s1. 提取待检样品中的rna并反转录为cdna；

10、s2. 利用所述的检测副流感病毒5型的lamp引物组、以步骤s1获得的cdna为模板进行环介导等温扩增反应；

11、s3. 扩增反应程序完成后，通过判断扩增反应体系中是否扩增得到扩增产物来判断待检样品中是否含有副流感病毒5型。

12、优选，所述的步骤s2中，所述的环介导等温扩增反应的体系为25 μl：10×isothermal amplification buffer ii 2.5 μl，100 mm mgso41.0 μl，10 mm betaine2.5 μl，8u/μl bst 3.0 dna polymerase 1 μl，10 μm的外引物f3、b3分别加入1 μl，40 μm的内引物fip、bip分别加入1 μl，10 mm dntp mix 2.5 μl、cdna模板加入1.5 μl，加ddh2o补足至25 μl；所述的环介导等温扩增反应的程序为：65℃下恒温反应30-60 min，然后在80℃下恒温处理5 min。

13、本发明具有如下有益效果：

14、（1）检测成本低：应用本发明方法不依赖任何专门的仪器设备可实现现场高通量快速检测，用肉眼即可判断结果，检测成本低于pcr方法等。

15、（2）操作简单快捷：本发明摆脱了传统的形态鉴定方法和pcr法等复杂的操作流程，克服了对操作人员需要具备一定的实验技能、实验样品需要经过严格的处理以及耗时耗力等问题。应用本发明方法检测时，只需在恒温条件下处理30-60 min即可通过肉眼判定结果，而且不受实验条件的限制。

16、（3）高特异性：本发明针对piv5这一类群的一种特异性基因片段设计引物，具有对piv5非常高的特异性识别能力，且灵敏度高，结合快速，应用本发明的lamp引物组可快速、高效地检测出样品中是否含有piv5。

技术特征：

1. 一种检测副流感病毒5型（parainfluenza virus 5）的lamp引物组，其特征在于，包括一对外引物f3和b3以及一对内引物fip和bip；所述的外引物f3，其核酸序列如seq idno.1所示；所述的外引物b3，其核酸序列如seq id no.2所示；所述的内引物fip，其核酸序列如seq id no.3所示；所述的内引物bip，其核酸序列如seq id no.4所示。

2.一种检测副流感病毒5型的试剂盒，其特征在于，包括环介导等温扩增试剂和权利要求1所述的检测副流感病毒5型的lamp引物组。

3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的环介导等温扩增试剂包括bst3.0 dna polymerase、10× isothermal amplification buffer ii、dntp mix、betaine和mgso4。

4. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测副流感病毒5型的lamp引物组中，外引物f3和b3的浓度为10 μm，内引物fip和bip的浓度为40 μm。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测副流感病毒5型的试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品，所述的阳性对照品为含有副流感病毒5型np基因的重组质粒，所述的阴性对照品为depc处理的ddh2o。

6.权利要求1所述的检测副流感病毒5型的lamp引物组在检测副流感病毒5型中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的步骤s2中，所述的环介导等温扩增反应的体系为25 μl：10× isothermal amplification buffer ii 2.5 μl，100 mm mgso41.0 μl，10 mm betaine 2.5 μl，8u/μl bst 3.0 dna polymerase 1 μl，10 μm的外引物f3、b3分别加入1 μl，40 μm的内引物fip、bip分别加入1 μl，10 mm dntp mix 2.5 μl、cdna模板加入1.5 μl，加ddh2o补足至25 μl；所述的环介导等温扩增反应的程序为：65℃下恒温反应30-60 min，然后在80℃下恒温处理5 min。

技术总结本发明公开了一种检测副流感病毒5型的LAMP引物组、试剂盒及其应用。本发明的引物组能够特异性的扩增副流感病毒5型，利用该引物组及其荧光可视化快速检测试剂盒可实现对副流感病毒5型的高灵敏度和高特异性检测，且最低检测限可达到2.16×10<supgt;0</supgt; copies/μL，特异性强不与其它穿山甲相关病毒反应，反应时间全程只需要30分钟就能完成检测，反应后可通过在紫外灯下观察反应产物颜色直接读取结果、不依赖大型实验设备。本发明的引物组及试剂盒可良好地应用于鉴定副流感病毒5型，适用于临床和实验室检测。技术研发人员：华彦,刘桂红,邹碧山,冉重阳,王凯,刘昊,毕诗曼,董晓欣受保护的技术使用者：广东省林业科学研究院技术研发日：技术公布日：2024/6/13