41个人类染色体基因座的复合扩增试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及分子遗传学和生物技术基因检测领域，具体涉及41个人类染色体基因座的复合扩增试剂盒及其应用。

背景技术：

1、目前dna检测技术已经广泛应用于亲缘关系鉴定、法医dna分析、医学遗传学、人类学、细胞系鉴定等领域。str(短串联重复序列)基因座由长度为3-7个碱基对的短重复序列元素组成，具有高度多态性，str基因座数量大，分部广泛，可以使用聚合酶链式反应进行检测。是目前进行亲权鉴定最权威、最常用的标记。

2、近年来随着遗传标记的广泛应用，在日常法医实践检案过程中，除了个体识别、常规的标准三联体、二联体亲子鉴定案件外，二级亲缘关系如祖孙、叔侄、全同胞、半同胞关系鉴定实践检案量也在逐年递增。

3、20个str完全足以进行个体识别、常规的标准三联体、二联体亲子鉴定，但在进行有突变的三联体、二联体亲子鉴定时，根据《亲权鉴定技术规范》（sf/z jd0105001-2016），当累计亲权指数小于10000大于0.0001时，需要增加检测更多的str基因座来提升比对准确性。进行亲子鉴定的常规做法是，第一步先用20至25个常str基因座进行检查，如果基因座有突变，再用常染色体补充试剂盒如goldeneye 22nc进行加测。这一做法的缺点在于，需要进行两次扩增检测，耗费双倍时间才能得到准确可靠的结果。

4、复杂亲缘关系单亲比对，进行生物学全同胞关系鉴定时，根据《生物学全同胞关系鉴定技术规范》（sf/t 0117-2021）中规定：根据需要增加与19个必检str基因座（vwa、d21s11、d18s51、d5s818、d7s820、d13s317、d16s539、 fga、d8s1179、d3s1358、csf1po、th01、tpox、penta e、penta d、d2s1338、d19s433、d12s391、d6s1043）不存在连锁不平衡的其他常染色体str基因座，以便提高系统效能。19个必检基因座的系统效能只有0.5655，19个必检基因座加上20个补充基因座的系统效能大幅提高，可以达到0.9782 。同样，进行生物学祖孙关系鉴定时，根据《生物学祖孙关系鉴定规范》（sf/z jd0105005-2015）中规定：鼓励在19个str基因座（vwa、d21s11、d18s51、d5s818、d7s820、d13s317、d16s539、 fga、d8s1179、d3s1358、csf1po、th01、tpox、penta e、penta d、d2s1338、d19s433、d12s391、d6s1043）基础上增加更多的、经过验证的、与上述19个str基因座不存在连锁和连锁不平衡的其它常染色体str基因座，以提高检测系统效能。

5、目前公安部公布了在20个常染色体str核心基因座(包含amelogenin、csf1po、d3s1358、d5s818、d7s820、d8s1179、d13s317、d16s539、d18s51、d21s11、fga、th01、tpox、vwa、d2s1338、d19s433、d6s1043、d12s391、penta d、penta e)基础上又增加了10个常染色体str优选基因座(10个基因座，包含d1s1656、d2s441、d22s1045、d10s1248、d8s1132、d15s659、d3s3045、d19s253、d6s477、d10s1435) 以及30个常染色体str备选基因座。

6、这些以上所有的信息都提示，在实际应用中，常染色体str的基因座数量和信息量需求在不断的增加。

7、综上所述，dna鉴定领域亟需开发一款包含20个常染色体str核心基因座、10个常染色体str优选基因座以及市面上使用频率较高的备选基因座的扩增试剂盒，以达到提高工作效率、提高检测系统效能、具有更好兼容性的目的。

技术实现思路

1、为提高工作效率、提高检测系统效能、具有更好兼容性，本发明提供一种能够同时检测41个染色体基因座的复合扩增试剂盒及其应用。

2、一方面，本发明提供一种用于人类染色体dna分型的基因座分子标记，所述分子标记包括如下人类染色体上的41个基因座：常染色体的39个str基因座：d3s1358、csf1po、d2s441、d21s11、penta e、d15s659、d7s3048、d3s1744、d8s1179、d5s818、d19s433、d16s539、penta d、d8s1132、d14s608、d18s535、vwa、d2s1338、d18s51、d22s1045、d6s477、d4s2366、d11s2368、th01、d12s391、tpox、fga、d19s253、d17s1290、d13s325、d13s317、d1s1656、d10s1248、d6s1043、d7s820、d10s1435、d3s3045、d5s2500、d22gata198b05 ；1个性别识别基因座amelogenin；1个y indel位点。

3、一种用于扩增所述的人类染色体上的41个基因座的引物混合物，包括序列如seqid no.1~82所示的41对引物。

4、另一方面，本发明提供一种41个人类染色体基因座的复合扩增试剂盒，其包括所述的41个基因座的扩增引物。

5、本领域技术人员应当理解，用于复合扩增所述41个基因座的产品可以根据需要制备为不同的形式，其包括但不限于检测试剂、试剂盒、检测或扩增体系，所有包括所述41个基因座的扩增引物且能够实现所述41个基因座的复合扩增的产品均在本发明的保护范围内。

6、优选的，所述复合扩增试剂盒的引物成分为如下引物组成的混合物：41个基因座的扩增引物。

7、优选的，所述41个基因座的扩增引物的序列如seq id no.1～82所示：其中，d3s1358、seq id no.1～2；csf1po、seq id no.3～4；d2s441、seq id no.5～6；d21s11、seqid no.7～8；penta e、seq id no.9～10；d15s659、seq id no.11～12；d7s3048、seq idno.13～14；d3s1744、seq id no.15～16；d8s1179、seq id no.17～18；d5s818、seq idno.19～20；d19s433、seq id no.21～22；d16s539、seq id no.23～24；penta d、seq idno.25～26；d8s1132、seq id no.27～28；d14s608、seq id no.29～30；d18s535、seq idno.31～32；y indel、seq id no.33～34；amel、seq id no.35～36；vwa、seq id no.37～38；d2s1338、seq id no.39～40；d18s51、seq id no.41～42；d22s1045、seq id no.43～44；d6s477、seq id no.45～46；d4s2366、seq id no.47～48；d11s2368、seq id no.49～50；th01、seq id no.51～52；d12s391、seq id no.53～54；tpox、seq id no.55～56；fga、seq id no.57～58；d19s253、seq id no.59～60；d17s1290、seq id no.61～62；d13s325、seq id no.63～64；d13s317、seq id no.65～66；d1s1656、seq id no.67～68；d10s1248、seq id no.69～70；d6s1043、seq id no.71～72；d7s820、seq id no.73～74；d10s1435、seq id no.75～76；d3s3045、seq id no.77～78；d5s2500、seq id no.79～80；d22gata198b05 、seq id no.81～82。

8、更优选的，所述复合扩增试剂盒中的引物在扩增时的工作浓度如下：d3s13580.05µm、csf1po 0.03µm、d2s441 0.04µm、d21s11 0.05µm、penta e 0.06µm、d15s659 0.1µm、d7s3048 0.08µm、d3s1744 0.3µm、d8s1179 0.07µm、d5s818 0.04µm、d19s433 0.05µm、d16s539 0.1µm、penta d 0.09µm、d8s1132 0.15µm、d14s608 0.07µm、d18s535 0.04µm、yindel 0.04µm、amel 0.02µm、vwa 0.09µm、d2s1338 0.06µm、d18s51 0.06µm、d22s10450.08µm、d6s477 0.05µm、d4s2366 0.05µm、d11s2368 0.08µm、th01 0.03µm、d12s391 0.04µm、tpox 0.04µm、fga 0.05µm、d19s253 0.06µm、d17s1290 0.09µm、d13s325 0.09µm、d13s317 0.02µm、d1s1656 0.05µm、d10s1248 0.03µm、d6s1043 0.05µm、d7s820 0.08µm、d10s1435 0.10µm、d3s3045 0.08µm、d5s2500 0.06µm、d22gata198b05 0.2µm 。

9、为实现所述41个基因座的同时快速扩增，可以选择六色荧光标记系统对所述扩增引物进行荧光染料标记。

10、所述荧光染料标记方法如下：将所述的41个基因座的扩增引物分为如下五组，分别用五种不同颜色的荧光染料标记五组的扩增引物，每组的扩增引物采用同一种颜色的荧光染料标记，每个基因座的一条扩增引物被荧光染料标记：第一组为d3s1358、csf1po、d2s441、d21s11、penta e、d15s659、d7s3048、d3s1744；第二组为d8s1179、d5s818、d19s433、d16s539、penta d、d8s1132、d14s608、d18s535；第三组为y indel、amelogenin、vwa、d2s1338、d18s51、d22s1045、d6s477、d4s2366、d11s2368；第四组为th01、d12s391、tpox、fga、d19s253、d17s1290、d13s325；第五组为d13s317、d1s1656、d10s1248、d6s1043、d7s820、d10s1435、d3s3045、d5s2500、d22gata198b05 。

11、所述的第一组的荧光染料标记的颜色为蓝色，所述的第二组的荧光染料标记的颜色为绿色，所述的第三组的荧光染料标记的颜色为黄色，所述的第四组的荧光染料标记的颜色为红色，第五组的荧光染料标记的颜色为紫色。优选的，其中，蓝色标记为5-fam或6-fam荧光素分子，绿色标记为hex或joe荧光素分子，黄色标记为tamra或l552荧光素分子，红色标记为rox或lr600荧光素分子，紫色标记为l592或nh618荧光素分子；更优选的，五种不同颜色的荧光染料标记为 6-fam 、hex 、l552、lr600、l592。

12、荧光素分子的选择包括但不限于上述具体的荧光素分子，本领域技术人员也可以根据需要选择其它与上述荧光素分子的光谱相近的荧光素分子。

13、优选的，试剂盒的两个内部质量参考分为一组，采用橙色荧光染料标记，选择org荧光素分子。

14、更优选的，所述荧光染料标记为在引物的5’端进行标记。

15、所述的复合扩增试剂盒的扩增反应程序如下：95℃~98℃ 1 min~5 min；94℃~98℃ 5s~30s、58℃~62℃ 1min~2.5 min，共26~35个循环；60℃终延伸5 min~30 min。

16、优选的，所述的扩增反应程序如下：95℃ 2min；94℃ 5s、60℃ 2min，共28个循环；60℃终延伸5min。

17、所述41个基因座的复合扩增试剂盒在进行扩增时，其10µl的扩增反应体系如下：2.5×反应预混液4µl，5×引物混合物2µl，去离子水3µl，模板dna 1µl，其中引物混合物为所述的41个基因座的扩增引物混合物。

18、优选的，本发明提供的复合扩增试剂盒还包括含有镁离子、dntp、dna聚合酶的反应预混液，41个基因座的等位基因ladder，dna标准品和荧光分子量内标。

19、本领域技术人员应该理解，聚合酶链式反应（pcr）扩增的主要成分包括模板、引物、dntp、dna聚合酶以及dna聚合酶的缓冲液等。

20、其中，dna聚合酶可以为抗体封闭修饰或化学修饰的热启动dna聚合酶。每个扩增体系(10ul)一般需要0.5u~3u的taq dna聚合酶。

21、反应预混液包括dntp、dna聚合酶以及dna聚合酶的缓冲液；其中，dna聚合酶的缓冲液可以包括：50mm kci，50mm tris-hci (ph8.3，25℃)，2.0mm mgcl2，0.1mg／ml bsa（牛血清白蛋白）等。本领域技术人员可以根据实际需要选择dntp、dna聚合酶以及与之匹配的缓冲液的分开的单独试剂，或者选择使用将dntp、dna聚合酶以及dna聚合酶的缓冲液等制备成预混液的用于pcr扩增的常规试剂材料，以上选择均在本发明保护的范围内。

22、进一步地，本发明还提供一种人类染色体41个基因座的复合扩增方法，包括如下步骤：

23、（1）样品处理：提取样品的基因组dna作为扩增模板或直接采用免提取的样品作为扩增模板；

24、（2）利用序列如seq id no.1~82所示的扩增引物对步骤（1）获得的样本基因组dna进行扩增；

25、（3）扩增产物的荧光信号检测；

26、（4）收集荧光信号数据，分析得到41个基因座的dna分型结果。

27、其中，所述样品包括血液、血斑、精液、精斑、骨骼、毛发、唾液、唾液斑、汗液和含有胎儿细胞的羊水中的一种或多种；所述免提取的样品包括滤纸、血卡、棉签、纱布中的一种或多种载体收集的人类血液或脱落细胞。

28、优选的，所述提取样品的基因组dna可以采用chelex法、磁珠提取法或有机法抽提法的任意一种基因组提取方法。

29、优选的，所述样品的dna模板量优选为0.5ng~4ng。

30、扩增反应可以在各种反应热循环仪上进行，如abi 9700、abi 9600、abi2720、bio-rad icycler、bio-rad cl000等。

31、所述扩增产物带有荧光染料标记，荧光标记可以在激光激发下发光信号，步骤（3）中的荧光信号检测可以通过测序仪或遗传分析仪等仪器进行电泳和检测；其中，分析测序仪包括但不限于abi 377、310dna sequencer，遗传分析仪包括但不限于abi 3130、3100、3730系列genetic analyzer。

32、具体地，在测序仪或遗传分析仪上进行检测时，扩增产物与分子量内标(marker，internal lane standard)、以及甲酰胺按照一定比例混合，进入仪器毛细管或凝胶中电泳分离。分子量内标是由多条己知长度的荧光标记dna片段组成，用来计算pcr扩增产物片段长度，从而可以判断基因分型以及与等位基因阶梯比对。

33、收集的荧光信号等数据可以在genemapper、genemarker、genescan等数据分析软件上分析，最终得到str基因分型图谱和数据。

34、更进一步地，本发明提供所述的分子标记或所述的复合扩增试剂盒或所述的扩增引物组在个体识别或亲子鉴定中的应用或在人类染色体dna基因座的数据库构建中的应用。

35、本发明主要技术方案的设计构思如下：

36、1、41个人类染色体基因座组合的筛选

37、选择目标基因座的考虑因素主要包括其遗传多态性、与现有检测试剂盒的兼容性以及新增基因座对提高个体识别能力的贡献等。发明人针对不同个体，通过对数据库中大量基因座的染色体的遗传多态性，并在对现有试剂盒利用的基因座进行充分分析的基础上，最终确定以下41个染色体基因座的组合：常染色体的39个str基因座：d3s1358、csf1po、d2s441、d21s11、penta e、d15s659、d7s3048、d3s1744、d8s1179、d5s818、d19s433、d16s539、penta d、d8s1132、d14s608、d18s535、vwa、d2s1338、d18s51、d22s1045、d6s477、d4s2366、d11s2368、th01、d12s391、tpox、fga、d19s253、d17s1290、d13s325、d13s317、d1s1656、d10s1248、d6s1043、d7s820、d10s1435、d3s3045、d5s2500、d22gata198b05 ；1个性别识别基因座amelogenin；1个y indel位点。本发明的试剂盒除了突破了目前能够实现的最多的复合扩增同时检测基因座的数目，同时具有显著提高的个体识别能力和非父排除率。所述41个基因座在电泳图谱上的排布位置如图1所示。

38、2、六色荧光标记技术的开发

39、传统的五色荧光标记技术限制了复合扩增基因座的数量，而目前常用的几种六色荧光技术存在部分荧光染料发射波长过于接近导致遗传分析仪无法完全自动去除荧光染料信号间的相互渗透，从而产生渗透峰的问题。也存在着由于荧光素分子的最大吸收光波长与遗传分析仪激发光波长较远而导致的荧光发光效率低下的问题。综合考虑荧光素的物理和化学性质以及检测仪器的波长等因素，经过大量的筛选和对比实验，最终选择合适波长的荧光素与传统的五色荧光技术配合使用，开发用于复合扩增的六色荧光标记技术。

40、本发明经大量的优化实验得到如下优选的分组：第一组为d3s1358、csf1po、d2s441、d21s11、penta e、d15s659、d7s3048、d3s1744；第二组为d8s1179、d5s818、d19s433、d16s539、penta d、d8s1132、d14s608、d18s535；第三组为y indel、amelogenin、vwa、d2s1338、d18s51、d22s1045、d6s477、d4s2366、d11s2368；第四组为th01、d12s391、tpox、fga、d19s253、d17s1290、d13s325；第五组为d13s317、d1s1656、d10s1248、d6s1043、d7s820、d10s1435、d3s3045、d5s2500、d22gata198b05 。

41、然后，针对上述41个基因座在其重复序列的侧翼和indel插入/缺失位点的侧翼处分别设计特异性引物。引物设计的基本原则如下：每条引物退火温度接近或高于60℃。不能产生引物二聚体、引物内部的发夹结构等二级结构以及交叉反应，扩增产物长度在65-600bp之间。对每对引物进行扩增测试并优化，直至得到清晰单一扩增条带。

42、利用每组基因座的引物对进行复合扩增试验。确定该组没有非特异扩增现象，无交叉反应等情况后，经不断调整每对引物的浓度，使组内各个片段峰值均衡性达到50%以上。

43、将五组基因座和一组内标的引物分别用蓝色、绿色、黄色、红色、紫色和橙色荧光素标记。每对引物中只标记一条链，标记在引物的5’端。蓝色标记可选择5-fam、6-fam 或相近光谱的荧光素分子，绿色标记可选择hex、joe 或相近光谱的荧光素分子，黄色标记可选择l552 或相近光谱的荧光素分子，红色标记可选择lr600或相近光谱的荧光素分子，紫色标记可选择l592或相近光谱的荧光素分子，橙色标记可以选择org。

44、最后，将五组41个基因座进行复合扩增，对产生非特异扩增的引物进行不断优化，根据产物峰高情况调整各基因座引物浓度，经大量的优化和筛选，确定引物混合物中41对引物的最佳工作浓度，使得各基因座峰值整体均衡性达到30%以上。

45、本发明的有益效果在于：

46、（1）本发明首次建立了同时扩增包括39个常染色体str基因座、1个y indel和1个amelogenin基因座的复合扩增体系，通过巧妙的引物序列及使用浓度设计，改进的六色荧光标记技术，实现了41个基因座的同时高效、特异、灵敏的扩增，是目前报道的人类dna分型技术能够实现同时扩增的基因座数量较多的复合扩增体系；

47、（2）本发明提供的41个人类染色体基因座的组合，整合了目前国内外主流dna分型检测试剂所采用的全部基因座，具有很好的分析数据兼容性，不仅能够兼容目前我国dna数据库中已有的全部数据，并且对新一代产品也有很高的兼容性，克服了现有技术中的检测试剂的数据兼容性的问题；

48、（3）本发明提供的41个人类染色体基因座的遗传信息，高于同时使用现有技术中2-3个同类产品得到的信息量，无论在pcr扩增和遗传分析仪检测环节，都节省了50%以上人力、时间和物料成本，提高了检测的工作效率；

49、（4）本发明提供的41个人类染色体基因座的复合扩增试剂盒，具有较高的系统效能，参考吴薇薇等在中国法医学杂志发表的文章中的41个str基因座遗传学统计参数，计算得到累计人体识别能力（tdp）为1-1.8109×10-47，三联体亲子鉴定累计非父排除概率（cpetrios）为1-4.4556×10-17，二联体亲子鉴定累计非父排除概率（cpeduos）为1-5.9513×10-17。能够满足个体识别、常规标准三联体、二联体亲子鉴定案件以及复杂亲缘关系如祖孙、叔侄、全同胞、半同胞关系的鉴定，具有很高的应用价值；

50、（5）本发明提供的复合扩增试剂盒具有很强的检材适应性，一种试剂盒可以扩增包括利用chelex法、磁珠提取法或有机法抽提法中任意一种方法提取的人基因组dna以及滤纸、fta卡、棉签、纱布等任意一种载体收集的人类血液或脱落细胞多种检材的样本；

51、（6）本发明提供的复合扩增体系具有较强的扩增特异性、并且温度耐受范围较广，能够保证不同的pcr扩增仪均能得到较好的扩增结果。