一种基于折射率匹配法的酶联免疫检测的三维固相基材及其制备方法和应用

本发明涉及医学检测，具体涉及一种基于折射率匹配法的酶联免疫检测的三维固相基材及其制备方法和应用。

背景技术：

1、酶联免疫检测是常见的抗体或抗原测定方法。传统的酶联免疫法通过在平板固相基材上吸附抗体，进而特异性的捕获待测生物标志物，通过酶标仪测定可对生物标志物进行定量分析。酶联免疫检测方法具有通用性高，特异性强，重复性好等特点。由于其试剂稳定、易保存，操作简便，结果判断较客观等因素，已广泛应用在生物医学检验的各领域中。

2、快速免疫检测基于酶联免疫检测试剂盒，在诊断性指标对比中，检测试剂盒可对大批量标本进行检测，有助于进一步实现检测的标准化、自动化及规范化。目前市场上所售的检测试剂盒仅在酶标孔板底部吸附一层包被抗体，吸附量固定，造成灵敏度无法提高，导致检测试剂盒的检测范围较窄。

3、cn202433382u公开了一种用于酶联免疫吸附测定的固相载体及试剂盒，其中固相载体采用可结合蛋白的纤维素膜，尤其是硝酸纤维素膜，代替传统的聚苯乙烯微孔板，可提高检测灵敏度，降低酶标记物和底物的使用量，从而节约成本，降低产品价格。但其抗体吸附量还有待提高，采用的硝酸纤维素膜仍然为一维的平板结构。

4、cn104195127a公开了一种酶固定化载体的制备方法及应用，尤其公开了一种利用聚电解质球刷为载体，采用静电吸附后化学偶联法实现对酶的固定化，并将制备得到的复合物应用于酶联免疫检测。实现了酶的高结合量和高活性，应用于酶联免疫检测中，显著提高酶联免疫检测的灵敏度。但其载体的制备方法过程复杂，也载体的透光性问题未曾提及。

技术实现思路

1、本发明针对传统酶联免疫检测试剂盒存在的灵敏度不足的问题，提供一种用于酶联免疫检测的三维固相基材的制备方法，该基材不仅折射率与水接近，具有遇水透光的特性，抗体吸附量高，制备的试剂盒相较于传统检测试剂盒的灵敏度进行优化，对大批量痕量目标检测物进行有效检测。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

3、一种酶联免疫检测的三维固相基材的制备方法，包括步骤：步骤1，将聚合物亲水材料浸渍于修饰材料的溶液中进行表面修饰，清洗干燥；

4、步骤2，将步骤1得到的材料浸渍活化剂的溶液中进行活化，清洗干燥，得到所述三维固相基材；

5、步骤3，将活化后的固相基材与一抗进行孵育，通过固相基材上的羧基与一抗上的氨基结合，形成带有免疫修饰层的三维固相基层。

6、所述聚合物亲水材料遇水时透光率在80％以上，实现高负载透光的特性。所述聚合物亲水材料本身的折射率与水接近，优选折射率在1.0-1.5的材料。

7、酶联免疫法是测定生物液体样本中蛋白类生物标志物的常用检测方式，但该方法受制于二维平面的抗体固定技术无法进一步提升检测灵敏度，因此对低浓度生物标志物的检测受到限制。

8、本发明中以光学折射率与水接近的聚合物亲水材料为基材，该结构具有大量孔隙，经过化学基团修饰和化学键活化后，形成三维结构增加比表面积，表面可固定大量免疫类抗体蛋白用于酶联免疫检测，提高检测的灵敏度和检测浓度范围。该基材同时兼具亲水性和与水相近的折射率，遇水后基材会变透明从而不影响酶标仪光学检测，减少了基材自身背景过高导致光路受阻带来的干扰。

9、优选地，所述聚合物亲水材料为醋酸纤维素、聚偏氟乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯马来酸酐共聚物、硝酸纤维素、聚氨酯、丙烯酰胺、丝素蛋白(sf)的任意一种或多种。这些材料具有与水接近的折射率，在接触检测液体时能够呈现透明，保持良好的透光性。

10、优选地，所述聚合物亲水材料的厚度为10-100μm，孔隙率为30-90％，孔径为100nm-50μm。该材料具备多孔、比表面积大的优势，但厚度不能太高，需要兼顾透明性，使得最终制得的三维固相基材可大幅提升抗体附着量，并具有优异的透明性。

11、所述聚合物亲水材料的制备方法包括静电纺丝、旋涂、浸涂、刮膜、水凝胶、微喷打印直写中任一种。所述聚合物亲水材料可通过多种方法制备而得，通过控制制备过程中的工艺，如纺丝时间、旋涂速度、浸涂体积、刮刀厚度、水凝胶体积、微喷打印时间等，以保证材料的厚度为10-100μm范围，太厚影响膜基体对光路折射、吸收的影响，厚度太薄抗体的吸附量增幅不明显。

12、所述聚合物亲水材料的孔隙率也可通过控制制备方法中聚合物溶液的浓度来调整正，促使制备的聚合物亲水材料的孔隙率范围在30-90％，孔径范围为100nm-50μm。

13、进一步优选地，所述聚合物亲水材料的厚度为10-50μm，孔隙率为60-90％，孔径为5-20μm。优选范围内透光效果更好，透光率可达85％以上。

14、进一步地，所述聚合物亲水材料采用静电纺丝制备时，实验参数如下：纺丝电压为9-20kv；纺丝距离为8-19cm；纺丝时间为9-10min；推液量为0.8-1.2ml/h；由旋涂法制备的膜基体，实验参数如下：旋涂转速为800-2500rpm；旋涂时间为10-40s；滴液量为100-500μl；

15、所述修饰材料氯化钙-羧甲基纤维素钠、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物、聚乙烯亚胺、戊二醛的一种或多种；

16、所述活化剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、n-羟基琥珀酰亚胺、吗啉乙磺酸的任意一种或多种。

17、所述修饰材料的溶液的质量浓度为0.5-3.5wt％，所述活化剂的溶剂质量浓度为0.3-3wt％。

18、优选地，步骤1的浸渍温度为室温，浸渍时间为15-60min；步骤2的浸渍温度为室温，浸渍时间为15-60min。

19、优选地，步骤1中聚合物亲水材料可经过多种修饰材料溶液依次进行化学修饰。

20、优选地，经步骤1修饰后的材料采用pbst浸泡洗涤，再用氮气吹干。

21、本发明还提供根据所述的制备方法制得的酶联免疫检测的三维固相基材。该基材的亲水性高，与水的折射率相近，能够在接触检测液时能被完全浸润且透明。

22、本发明还提供一种酶联免疫检测方法，采用酶联免疫方法，以所述三维固相基材吸附抗体后进行目标检测物检测。具体包括将所述三维固相基材与一抗进行孵育，通过固相基材上的羧基与一抗上的氨基结合，形成带有免疫修饰层的三维固相基层，在将该基材用于检测。

23、如将所述三维固相基材封闭在96孔板中，孵育包被抗体过夜。完成抗体包被后可在96孔板中直接进行酶联免疫检测，吸光度变化可以由酶标仪读取。

24、所述酶联免疫方法包括双抗体夹心法、双位点一步法、竞争法中任意一种；

25、所述目标检测物包括生物液体样本中的肿瘤标志物、炎症标志物、肝肾功能标志物、代谢标志物、心血管标记物中任意一种。

26、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

27、(1)本发明的三维固相基材相较于传统的的二维平板结构基材，具有更高比表面积，有效增大了抗体吸附位点，提升酶联免疫检测的灵敏度。

28、(2)本发明构建的三维固相基材展现了良好的亲水性及遇水透光性能，降低了多孔基材自身透光性差导致的光路受阻程度，减少了基材修饰对检测带来的干扰。

29、(3)本发明构建的三维固相基材兼容现有的酶联免疫试剂及仪器，如常用的酶联免疫试剂，如一抗、hrp二抗等，也兼容于常规的酶标仪，在提升灵敏度的同时维持了酶联免疫试剂盒较低的检测成本。

30、(4)本发明的三维固相基材可通过模块化包被一抗制备检测试剂盒，可适用于生物液体样本中多种生物标志物的快速免疫检测。