一种低电内渗琼脂糖及其制备方法

本发明属于生物化学，涉及一种低电内渗琼脂糖及其制备方法。

背景技术：

1、琼胶，又名琼脂、冻粉、洋菜、大菜、洋粉、凉粉、燕菜等，是一种从凝花菜属、石花菜属、江蓠属、伊谷藻属、鸡毛菜属、紫菜属等红藻中提取的广泛用于食品、医药、日常化工、生物工程等领域的多糖。琼胶主要是由琼二糖骨架组成的中性糖（含有不同的甲基）经一系列含低电荷的硫酸基及丙酮酸等基团过渡到具有高电荷、呈酸性的取代基的琼脂糖衍生物的混合体，其主要由琼脂糖和硫琼胶组成。琼胶的熔化温度、凝固温度、凝胶强度、多糖组成和产率等取决于海藻的种类、收获季节、生长环境以及提取方法。琼胶、褐藻胶和卡拉胶并称为世界三大用途最广泛的海藻胶工业产品。

2、琼脂糖是不含有硫酸基的非离子型多糖，由1,3连接的β-d-半乳糖和1,4连接的α-3,6-内醚半乳糖构成的琼二糖线性交替连接形成的共聚物，具有凝胶功能。硫琼胶又名琼脂果胶，是琼胶中的复杂多糖且不具有凝胶功能。硫琼胶具有与琼脂糖基本相同的主链连接方式，但部分3,6-内醚半乳糖被半乳糖-6-硫酸基替代并结合着钙、镁等无机离子。由于硫酸基和羧基的影响，含硫琼胶的琼脂糖凝胶作为电泳支撑物，存在着电内渗大、吸附碱性染料和蛋白质的能力较强、在酸性缓冲液中亦可引起一些蛋白非特性沉淀、透明度差等缺点。

3、理想的琼脂糖是不含极性基团的中性多糖，但实际上很难获得完全不含极性基团的中性多糖。目前，现有技术制备出来的琼脂糖均带有微量的硫酸基和丙酮酸等极性基团，其可能是由于琼脂糖中仍然残留微量的硫琼胶。电内渗的大小是琼胶与琼脂糖的主要差别之一，也是衡量琼脂糖质量优劣的一项主要指标。在进行琼脂糖凝胶电泳时，琼脂糖中过多的硫琼胶使凝胶在直流电场下产生对流，影响样品的迁移和分离，直接表现为电内渗和蛋白质吸附。电内渗的大小主要与琼脂糖中含有的硫酸基和羧基有关，因而琼脂糖制备过程中，主要是去除其中含有硫酸基和羧基的多糖，降低其电内渗，同时在除去琼胶生产过程中掺入的少量藻类蛋白、不溶性沉淀、可溶性盐类和色素，从而提高琼脂糖纯度和产品的稳定性。

4、琼脂糖的纯化技术始于上世纪，1937年荒木在研究琼胶的组成与结构时，首次通过乙酰化方法除去琼胶中硫琼胶制备了琼脂糖。1961年瑞典科学家s.hjerten首次利用琼胶纯化了琼脂糖，第一次发现琼脂糖优异的使用性能后，对琼脂糖的研究才越来越多，并开始用于工业生产。1969年barteling等人通过用不溶性吸附剂从热琼胶溶液中吸附带电的硫琼胶来制备琼脂糖。1971年，duckworth 和yaphe建立了琼胶进一步分级得到琼脂糖的方法，1971年，allan等人提出了使用几丁质和壳聚糖与琼胶混合物共沉淀法来制备琼脂糖。近年来，离子液体（ils）作为一种新型溶剂开始应用于琼脂糖的制备，生物离子液体可生物降解和无毒的特性也增强了其作为琼脂糖分离溶剂的功能。琼脂糖提取技术很多，根据制备原理的不同大致可分为硫琼胶沉淀法、琼脂糖沉淀法、离子交换法、离子液体法及其他方法，上述方法除deae 纤维素法外，其他方法都存在收率低，产品色泽差，或者凝胶强度低，生产成本高等问题。deae 纤维素法虽然是比较成熟的工艺，但deae 纤维素对不同来源的琼脂适用性差且价格昂贵，限制了其应用范围及琼脂糖的规模化生产。因此寻找新的琼脂糖生产技术具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种絮凝剂联合法从琼胶中分离制备低电内渗琼脂糖，该方法简单高效，经济，环保，易操作实施，所得琼脂糖的硫酸基含量小于0.1%、电内渗小于0.1，凝胶性较好，能够达到分子生物学等领域对琼脂糖纯度的要求。

2、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种低电内渗琼脂糖的制备方法，包括如下步骤：

3、（1）配制质量分数为0.5%～5%的琼胶溶液，室温溶胀，加热至90～100 °c搅拌溶解，并置于40～90 °c的水浴锅中恒温放置；

4、（2）配制质量分数为0.1%～2%的无机絮凝剂水溶液，室温下搅拌溶解并置于40～90°c的水浴锅中恒温放置；

5、（3）配制质量分数为0.1%～4%的二甲基二烯丙基氯化铵(dmdaac)聚合物水溶液，室温下搅拌溶解并置于40～70°c的水浴锅中恒温放置；

6、（4）将步骤（1）所得的琼胶溶液在搅拌下，加入步骤（2）制备的无机絮凝剂溶液，两种溶液的体积比（w/w）为1:1～10:1，搅拌10～420min；

7、（5）将步骤（4）所得溶液在搅拌下，加入步骤（3）制备的有机絮凝剂溶液，两种溶液的体积比（w/w）为1:1～10:1，混合搅拌10～420min；

8、（6）将步骤（5）所得溶液趁热过滤或离心，收集滤液或上清液；

9、（7）向步骤（6）所得滤液中加入无水乙醇，置于4 °c下静置6h～24h，离心，然后用水多次洗涤并真空冷冻干燥；

10、（8）、将干燥的琼脂糖粉碎获得低电内渗琼脂糖。

11、优选地，所述步骤（1）中所用的琼胶原料来源于海洋红藻。

12、优选地，所述的海洋红藻为石花菜、江篱、龙须菜、伊谷草、紫菜、鸡毛菜、凝花菜中的任一种或几种。

13、优选地，所述步骤（2）中所用的无机絮凝剂为聚合氯化铁、聚合硫酸氯化铁铝、聚磷氯化铁、聚合硫酸铁的其中一种。

14、优选地，所述步骤（7）中，琼脂糖滤液和无水乙醇溶液混合后，溶液中乙醇的体积分数为50%～80%。

15、本发明还提供了采用上述方法制备的低电内渗琼脂糖，其硫酸根含量≤0.1%，电内渗≤0.1，凝胶强度≥1200 g/cm2，白度≥90。

16、利用琼胶生产琼脂糖技术的关键是使琼脂糖与硫琼胶分离，絮凝剂主要是带有正（负)电性的基团和水中带有负(正）电性的难于分离的一些粒子或者颗粒相互靠近，降低其电势，使其处于不稳定状态，并利用其聚合性质使得这些颗粒集中，并通过物理或者化学方法分离出来。硫琼胶由于链接硫酸基和羧基因而其带负电荷，本发明通过絮凝剂与其结合，产生絮状沉淀，使其从琼胶溶液中分离，从而获得琼脂糖溶液。

17、本发明的方法简单高效、经济、环保、易操作实施、所制备琼脂糖凝胶性能好，凝胶强度高，硫酸基含量小于0.1%，电内渗低于0.1，白度高于90，能够达到分子生物学等领域对低电内渗琼脂糖的要求。

技术特征：

1.一种低电内渗琼脂糖的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的低电内渗琼脂糖的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中所用的琼胶原料来源于海洋红藻。

3.根据权利要求2所述的低电内渗琼脂糖的制备方法，其特征在于：所述的海洋红藻为石花菜、江篱、龙须菜、伊谷草、紫菜、鸡毛菜、凝花菜中的任一种或几种。

4.根据权利要求1所述的低电内渗琼脂糖的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中所用的无机絮凝剂为聚合氯化铁、聚合硫酸氯化铁铝、聚磷氯化铁、聚合硫酸铁的其中一种。

5.根据权利要求1所述的低电内渗琼脂糖的制备方法，其特征在于：所述步骤（7）中，琼脂糖滤液和无水乙醇溶液混合后，溶液中乙醇的体积分数为50%～80%。

6.一种采用如权利要求1-5任一项所述的方法制备的低电内渗琼脂糖，其特征在于：其硫酸根含量≤0.1%，电内渗≤0.1，凝胶强度≥1200 g/cm2，白度≥90。

技术总结本发明属于生物化学技术领域，涉及一种低电内渗琼脂糖及其制备方法。该方法包括：1、配制琼胶溶液、加热溶解；2、配制无机絮凝剂溶液和二甲基二烯丙基氯化铵聚合物溶液并在40～100°C的水浴锅中保温；3、在搅拌条件下，向琼胶溶液中加入无机絮凝剂溶液并搅拌；4、在上述反应的溶液中，加入二甲基二烯丙基氯化铵聚合物溶液并搅拌；5、过滤，去掉滤渣，收集滤液；5、向滤液中加入乙醇进行醇沉；6、离心，水洗，真空冷冻干燥；7、粉碎得到低电内渗琼脂糖。本发明简单高效、经济、环保、易操作实施、所制备琼脂糖凝胶性能好，凝胶强度高，能够达到分子生物学等领域对低电内渗琼脂糖的要求。技术研发人员：张全斌,鞠豪,王晶,岳洋,耿丽华,吴宁受保护的技术使用者：中国科学院海洋研究所技术研发日：技术公布日：2024/6/18