一种用于辅助改善脂肪肝的藻类外囊泡及其制备方法与流程

本发明属于细胞，具体涉及一种用于辅助改善脂肪肝的藻类外囊泡及其制备方法和应用。

背景技术：

1、目前，nafld(nonalcoholic fatty liver disease，非酒精性脂肪肝)已成为临床最常见的慢性肝脏疾病。

2、随着脂肪肝发展程度的加深，约有10～20％的nafld会发展成nash(non-alcoholic steatohepatitis，非酒精性脂肪性肝炎)，并逐渐导致肝硬化的产生，最终可能发展为肝癌。在2002年，jorge marrero等统计发现，肝癌(hepatocellular carcinoma)的患病人群中，有13～38.2％与nafld相关。

3、因此，nafld的潜在医学风险不可忽视，在nafld阶段进行有效的医学介入，从而逆转脂肪肝的发展具有重要的医学意义。

4、目前，nafld缺乏有效的药理学治疗方案。尽管在nafld的轻度和中度阶段，通过有效的饮食结构调整和积极的运动辅助可以改善甚至逆转，但这两种方法均需要长时间持续进行。当今经济发达，食材的丰富程度远非从前能比，营养的摄入习惯也相对固定，因此大幅度调整饮食结构并长时间坚持，需要很强的自律能力；另外，因为消化机能存在差异，导致“地中海”饮食等适合脂肪肝人群的科学饮食方式的实施程度并不高；而对于关节劳损和运动机能退化的脂肪肝人群而言，需要长时间持续进行的大运动量锻炼也存在很大局限。所以，坚持长时间自我饮食调节和充足的运动量，对于脂肪肝人群有相当的实现难度。

5、因此，通过摄入功能性成分有效减缓脂肪肝的发展甚至逆转脂肪肝，对于当下的社会现状，具有重要的医学意义和实质性的社会价值。

6、随着细胞生物学技术的不断发展，细胞外囊泡(extracellularvesicle)已在不同领域显示出极具前景的医学价值。外囊泡最早的研究报道于1983年，在绵羊网织红细胞中发现了含有rna和蛋白质成分的小囊泡(30-150nm)结构，1987年johnstone将其命名为外泌体。2013

7、进一步地，所述xi型培养基的材料选自nahco3、nano3、nah2po4、kcl、k2hpo4、k2so4、mgso4·7h2o、cacl2·2h2o、feso4·7h2o、edta中的一种或多种；

8、进一步地，所述xii型培养基的材料选自nahco3、nacl、lino3、nh4no3,k2so4、mgso4、cacl2、feso4中的一种或多种；

9、进一步地，所述xiii型培养基包含a5培养基和b6培养基中的一种或多种；

10、所述a5培养基的材料选自h3bo3、mncl2·4h2o、znso4·7h2o、moo3、cuso4·5h2o中的一种或多种；

11、所述b6培养基的材料选自nh4·vo3、niso·7h2o、nawo4、ti(so4)2、co(no3)2·6h2o中的一种或多种。

12、进一步地，所述分离的步骤包括梯度离心、膜抽滤和超滤离心。

13、进一步地，所述梯度离心的过程包括三次梯度离心，三次的所述梯度离心的条件如下所示：

14、第一次梯度离心：600-1000g，8-20min；

15、第二次梯度离心：2500-3500g，15-30min；

16、第三次梯度离心：9000-11000g，30-60min。

17、所述梯度离心的温度为4-8℃；

18、所述超滤离心的条件为：4000-6000g，8-12min，所述超滤离心温度为4-8℃。

19、进一步地，所述膜抽滤的滤膜的孔径为0.45-0.65μm。

20、进一步地，所述螺旋藻选自钝顶螺旋藻、极大螺旋藻、盐泽螺旋藻、印度螺旋藻、纺锤螺旋藻中的一种或多种。

21、本发明通过使用梯度离心结合抽滤和超滤离心的组合方法对外囊泡进行分离，可以很好地平衡外囊泡的收获量、设备限制和成本这三个方面。先进行梯度离心再进行超滤，不仅可以在不使用超高速离心机的情况下依次去除细胞碎片和大的细胞器，还可以在减少超滤膜等耗材使用量的前提下，获得远比单一分离步骤更大收获量的螺旋藻外囊泡。该组合方法同时兼备更高的制备方便性和更低的生产成本，对于实际的量产，具有更现实的可操作性。

22、本发明还提供了一种用于辅助改善脂肪肝的藻类外囊泡，通过所述用于辅助改善脂肪肝的藻类外囊泡的制备方法制备得到。

23、本发明还提供了用于辅助改善脂肪肝的藻类外囊泡在药物辅料、药物载体和功能性食品中的应用。

24、本发明具有以下有益效果：

25、1.本发明首次从螺旋藻的培养基中分离获得外囊泡。本发明针对螺旋藻的生物学特性而年诺贝尔医学/生理学的三位得主均是研究外囊泡的先驱。随后，世界各国科学家进行了更广泛的研究，进一步推动了细胞外囊泡技术在各个领域的应用：肿瘤细胞的外泌体已用于临床检测，作为肿瘤筛查的重要参考；msc(间充质干细胞)的外泌体具有治疗阿兹海默症等多种神经系统疾病的潜力；来源于姜的外泌体会影响肠道菌群，从而巩固肠道的屏障功能，减轻小鼠的结肠炎；山药来源的外囊泡在动物模型中促进了成骨细胞的形成，有效防止了骨质疏松。外囊泡的生物学作用已被不断证实和应用。

26、目前，大规模人工养殖的藻类主要采用高通量培养器、培养跑道池等设备，在藻类收获以后，体积庞大的培养基则会进入废水处理流程，而藻类在生长过程中产生的极大量外囊泡会与培养基一同进行废弃处理。由于现今藻类外囊泡的研究尚在初期阶段，相关的基础研究和分离技术尚未成熟，因此藻类培养基中的巨量外囊泡被直接废弃，对于其潜在医学价值而言，是极大的生物资源浪费。所以，通过一系列优化操作收集藻类培养基中的外囊泡，深入研究其理化属性，并挖掘其应用方向，有非常重要的医学意义和经济价值。

27、因此，亟需找到一种技术来深入挖掘该生物资源的应用潜力，以及克服上述脂肪肝改善局限的新途径。

技术实现思路

1、本发明针对以上技术问题，公开了一种辅助改善脂肪肝的藻类外囊泡成分及其制备方法。该方法的生产过程稳定可控，制备过程简单可靠且重复性好，兼顾了制备成本的经济性和资源利用的完全性，为有效改善nafld的综合症状提供了全新的治疗选项。

2、本发明对螺旋藻外囊泡进行了系统的研究，并发现nafld动物模型对其有明显的响应，无论是器官和组织层面、分子生物学层面还是与脂肪代谢相关的关键信号通路等多层面的检测结果，均证实螺旋藻外囊泡对nafld有显著的改善效果。螺旋藻外囊泡的分离制备更充分地利用了生物资源，同时为nafld的改善带来了全新的有效选项。

3、本发明提供了一种用于辅助改善脂肪肝的藻类外囊泡的制备方法，包括如下步骤：

4、s1.将螺旋藻接种在xi型培养基中，常规培养，收集藻种；

5、s2.将步骤s1的螺旋藻藻种接种在xii型培养基中，震荡培养，收集藻种；

6、s3.将步骤s2的螺旋藻藻种接种放置在xiii型培养基中，常规培养，收集螺旋藻后，对xiii型培养基进行低温分离，得到螺旋藻外囊泡。

7、具体地，步骤s1中，所述培养的总时间为15-38d。

8、具体地，步骤s2中，所述震荡培养的条件为：震荡培养4-6次，时间为10-20min，每次震荡间隔时间为20-40min。

9、具体地，步骤s3中，所述常规培养的时间为12-14d。

10、特定优化的培养基体系，相对于传统培养方法获得了更大量螺旋藻外囊泡；经过深入的研究，本发明发现，螺旋藻外囊泡具有显著改善非酒精性脂肪肝的效果。因此，对于很多不适合长时间运动以及饮食结构调整的脂肪肝人群，螺旋藻外囊泡可作为功能性成分直接摄入，即可达到改善效果，具有明显的便捷性和持续有效性。

11、2.本发明使用的螺旋藻外囊泡，是在螺旋藻的系统培养完成后，通过高速离心结合超滤的组合方法从螺旋藻培养基中获得。该过程不仅不影响螺旋藻的收获量，还更全面地利用了生物资源，由于螺旋藻外囊泡对非酒精性脂肪肝具有显著的改善效果，因此，本发明在直接衍生出巨大的医学价值和经济价值的同时，降低了螺旋藻产品的总体生产成本，集中体现了简便、安全、环保和高效的特点。