西红花bHLH转录因子CsbHLH30、编码基因和应用

本发明属于基因工程应用，涉及西红花抗胁迫过程中能通过响应ja信号来显著提高抗氧化活性的一种重要转录因子，具体涉及西红花bhlh转录因子csbhlh30及其编码基因和应用。

背景技术：

1、西红花为鸢尾科植物番红花（ crocus sativus l.）的干燥柱头，亦称藏红花，原产于欧洲、地中海及中亚地区。西红花中特有的天然色素和芳香物质，是世界上公认的最昂贵的香料，素有“红色金子”之称，在高档纺织品、日化用品和保健品等行业极具开发价值。但是，西红花生药产量极低、且品质易受环境影响，产量和品质不稳定。

2、bhlh（basic/helix-loop-helix）转录因子家族因其高度保守的碱性/螺旋-环-螺旋结构域而得名，是植物中最大的转录因子家族之一，广泛存在于动植物中。bhlh转录因子家族参与植物许多生理过程，在植物生长调节、调控胁迫应答、次生代谢调控等方面发挥着关键作用，在生物合成、代谢和信号转导等方面具有广泛的功能。bhlh转录因子已被多种研究证实其可以通过响应ja信号来调控植物的胁迫响应，同时转录组分析发现西红花 csbhlh基因响应了ja信号。但目前关于csbhlh转录因子参与提高西红花抗氧化活性、抗胁迫的研究报道很少。

技术实现思路

1、为了填补西红花 csbhlh30基因的克隆、表达模式、功能分析以及西红花转录因子csbhlh30的空白；本发明公开了西红花 csbhlh30基因序列及编码的氨基酸序列，蛋白亚细胞定位，相关基因表达和酶活性分析，为揭示csbhlh30转录因子在西红花胁迫响应中的作用，并阐明西红花药材品质形成规律及培育高品质的西红花药材奠定基础。

2、一方面，本发明提供了西红花bhlh转录因子csbhlh30，上述转录因子csbhlh30包括具有如seq id no.2所示的氨基酸序列的多肽（蛋白质）；或由seq id no.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有西红花bhlh转录因子csbhlh30特征的蛋白质。上述西红花bhlh转录因子csbhlh30能够响应ja信号，提升转基因植物抗氧化活性。

3、另一方面，本发明提供一种编码上述西红花bhlh转录因子csbhlh30的编码基因。上述编码基因的核苷酸序列具体为：（a）碱基序列如seq id no.1第1～756位所示；或（b）与seq id no.1第1～756位所示的核酸有至少70%的同源性的序列。

4、在本发明中，“分离的dna”、“纯化的dna”是指，该dna或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该dna或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中相伴随的蛋白质分开。

5、在本发明中，西红花bhlh转录因子csbhlh30蛋白的编码基因，是指编码具有西红花蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如seq id no.1所示的第1～756位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于seq id no.1所示的第1～756位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与seq id no.1所示的第1～756位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出seqid no.2所示的序列。上述编码基因还可以指与seq id no.1所示的核苷酸序列的同源性至少70%的核苷酸序列。

6、在本发明中，可用实时荧光定量pcr的方法分析西红花 csbhlh30基因产物的表达模式，即分析西红花 csbhlh30基因的mrna转录物在细胞中的存在与否和数量。

7、此外，根据本发明的西红花 csbhlh30基因序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选西红花 csbhlh30基因相关同源基因或同源蛋白。

8、本发明的西红花 csbhlh30基因相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列来设计引物，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次pcr扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

9、当获得了有关序列后，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

10、此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

11、除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

12、本发明还提供一种重组表达载体，其包含上述的西红花bhlh转录因子csbhlh30的编码基因。上述重组表达载体为pcambia1304- csbhlh30。

13、本发明还提供一种上述的西红花bhlh转录因子csbhlh30的编码基因在提升西红花抗氧化活性中的应用。

14、上述应用包括：构建含有上述转录因子csbhlh30的上述编码基因的重组表达载体，并转化植物宿体，培育筛选得到转基因植株。

15、有益效果：西红花作为珍稀名贵中药材，市场需求大。本发明首次克隆西红花抗胁迫过程中重要调控蛋白即转录因子csbhlh30的编码序列，并采用荧光实时定量pcr的方法分析 csbhlh30基因的表达模式，烟草叶片表皮细胞瞬时表达分析转录因子csbhlh30的亚细胞定位，烟草过表达分析相关抗氧化活性，为今后利用基因工程技术调控 csbhlh30基因的时空表达，提高西红花抗氧化活性、抗胁迫、新品种选育方面提供了理论依据，具有很大的应用价值。

技术特征：

1.一种西红花bhlh转录因子csbhlh30，其特征在于，所述转录因子csbhlh30包括具有如seq id no.2所示的氨基酸序列的多肽。

2.一种编码权利要求1所述的西红花bhlh转录因子csbhlh30的编码基因，其特征在于，所述编码基因包括如seq id no.1所示的核苷酸序列。

3.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求2所述的西红花bhlh转录因子csbhlh30的编码基因。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为pcambia1304-csbhlh30。

5.一种权利要求2所述的西红花bhlh转录因子csbhlh30的编码基因在提升西红花抗氧化活性中的应用。

6.根据权利要求5所述的西红花bhlh转录因子csbhlh30的编码基因在提升西红花抗氧化活性中的应用，其特征在于，所述应用包括：构建含有所述转录因子csbhlh30的所述编码基因的重组表达载体，并转化植物宿体，培育筛选得到转基因植株。

技术总结本发明公开一种西红花bHLH转录因子CsbHLH30、编码基因及其应用，上述转录因子CsbHLH30包括具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。本发明还提供一种编码上述蛋白质的核酸序列SEQ ID NO.1。本发明为利用基因工程技术提升西红花抗氧化活性提供了理论依据，具有重要的应用价值。技术研发人员：邢丙聪,王诗瑜,陈婷,郑世诚,邵清松受保护的技术使用者：浙江农林大学技术研发日：技术公布日：2024/6/18