一种基于PRF1基因提高CAR-NK细胞治疗效果的方法与流程

本发明属于生物医药，具体涉及一种基于prf1基因提高car-nk细胞治疗效果的方法。

背景技术：

1、嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)改造的t细胞彻底改变了用于治疗癌症的细胞疗法领域，是肿瘤治疗近年来最重要的突破之一。目前，已有多款car-t产品获批上市，为肿瘤患者带来显著的临床获益。尽管该策略已被证明对b细胞恶性肿瘤有十分显著的临床效果，但其应用仍存在一定的局限性：一方面产生细胞因子释放综合征(crs)和免疫效应细胞相关神经毒性综合征；另一方面异基因t细胞(即使hla匹配)可能导致移植物抗宿主病(gvhd)的风险。另外，比较长的制备周期也制约了car-t细胞的进一步广泛应用。与t细胞相对应的，nk细胞占外周血淋巴细胞的5％～10％，是先天免疫系统的重要组成部分，在对抗病原体和癌细胞的第一线防御中发挥着关键作用。目前研究显示car改造的nk细胞可能会克服car-t细胞的上述不足，展示出显著的抗肿瘤效果，并且具有制备为“现货型”产品的潜力。因此，car-nk细胞在肿瘤的免疫治疗中展现出广阔的前景。

2、nk细胞对体内转化或其他异常细胞具有特异性杀伤作用。为了识别和保护健康细胞，nk细胞主要依赖于抑制性受体(例如杀伤细胞免疫球蛋白样受体kirs和nkg2a)与正常细胞上表达的组织相容性复合物(mhc)i类分子结合，并作为安全开关抑制nk细胞毒性。在临床试验中，nk细胞不会像t细胞诱发gvhd，这为它们在同种异体环境中的广泛应用和现成细胞治疗产品的产生开辟了新道路。与car-t细胞相比，car-nk细胞几乎不发生crs和神经毒性。而且，用于临床上car-nk细胞来源丰富，可从外周血(pb)、脐带血(cb)、人类胚胎干细胞(hesc)、诱导多能干细胞(ipsc)以及nk-92细胞系中产生。

3、nk细胞上表达的功能性car分子的基本结构包括一个由单链可变片段(scfv)组成的抗原识别域、一个细胞外铰链域、一个跨膜域和一个细胞内激活域。scfv由与接头结合的重链和轻链组成，决定car的特异性。铰链区将肿瘤抗原结合结构域连接到跨膜区，确保car的稳定性并提供易于接近靶蛋白的灵活性。跨膜区连接细胞外和细胞内car结构域，将car对接至细胞膜并将激活信号转导为细胞内激活信号。细胞内激活域的数量决定car的生成，激活域的各种组合被用来产生抗肿瘤反应。根据胞内区域的不同，car-nk已发展到第四代。第一代cars由一个信号区域的基本结构组成；第二代cars包含额外的共刺激域，如cd28或4-1bb；第三代cars具有多个共刺激域，包括免疫球蛋白超家族(cd28和icos)的成员，tnf受体超家族的成员(4-1bb，cd27，ox40和cd40)，以及其他如cd40l和tlrs。这些car-nk的改造，目的在于改善car-nk细胞的增殖，持久性和抗肿瘤能力。迄今为止，car改造对提高car-nk疗效的作用还需要大规模临床试验的支持。

4、car-nk细胞具有良好的临床安全性，但其在临床应用中仍存在一定的障碍。(1)nk细胞缺乏体内持久性。尽管添加外源细胞因子可以增强nk细胞的增殖和持久性，但也会引起个别不良毒性和其他免疫群体的免疫抑制。(2)目前car-nk在治疗血液肿瘤中取得不错的治疗效果，但由于肿瘤微环境的免疫抑制，在实体瘤中效果较差。有研究尝试结合检查点删除的car工程是增强nk细胞抗肿瘤活性的有效方法。(3)快速归位到肿瘤床对过继细胞治疗的疗效至关重要，它受到nk细胞分泌的趋化因子与肿瘤细胞分泌的趋化因子之间复杂相互作用的调节。目前有研究在小鼠模型中测试一些增加nk细胞向肿瘤部位转移的新策略，但仍需在临床试验中得到验证。(4)冻融过程对nk细胞存活率变化且细胞毒性明显降低。总的来说，目前各种改造的car-nk对肿瘤的杀伤效率普遍不高(详见表1)，显著提高car-nk的肿瘤杀伤活性是突破现有瓶颈、实现其广泛应用的关键。

5、表1现有研究中car-nk肿瘤杀伤活性小结

6、

7、注：e：effecter cell效应细胞；t：target cell靶细胞；e:t效应细胞与靶细胞数量比。

8、与car-t细胞相比，car-nk细胞具有自己独特的优点，是目前肿瘤细胞治疗领域的关键热点，但也面临着挑战，打破目前瓶颈的关键是显著提高其抗肿瘤活性；由于nk细胞调控网络的复杂性，单独依靠理性设计难以获得稳定的理想表型，亟需引入新的研究理论和体系，在此基础上开发“新一代”car-nk细胞产品，从而为肿瘤治疗带来新的突破。

技术实现思路

1、本发明第一方面的目的，在于提供定向突变prf1基因在增强nk细胞活性中的应用。

2、本发明第二方面的目的，在于提供一种增强nk细胞杀伤活性的方法。

3、本发明第三方面的目的，在于提供一种prf1突变体。

4、本发明第四方面的目的，在于提供一种免疫细胞。

5、本发明第五方面的目的，在于提供本发明第三方面的prf1突变体或本发明第四方面的免疫细胞在制备抗肿瘤产品或制备提高对肿瘤细胞杀伤作用的产品中的应用。

6、本发明第六方面的目的，在于提供一种产品。

7、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

8、本发明的第一个方面，提供定向突变prf1基因在增强nk细胞活性中的应用，所述prf1基因的核苷酸序列如seq id no:5所示

9、在本发明一些实施方式中，所述定向突变包括：

10、1)与seq id no:5相比，第92位碱基c突变成a；或

11、2)与seq id no:5相比，第134位碱基g突变成t；或

12、3)与seq id no:5相比，第212位碱基g突变成t；或

13、4)与seq id no:5相比，第226位碱基t突变成a。

14、在本发明一些实施方式中，所述定向突变后的prf1基因序列如seq id no:1～seqid no:4所示。

15、本发明的第二个方面，提供一种增强nk细胞杀伤活性的方法，包括在nk细胞内定向突变prf1基因的步骤，所述定向突变包括：

16、1)与seq id no:5相比，第92位碱基c突变成a；或

17、2)与seq id no:5相比，第134位碱基g突变成t；或

18、3)与seq id no:5相比，第212位碱基g突变成t；或

19、4)与seq id no:5相比，第226位碱基t突变成a。

20、在本发明一些实施方式中，所述定向突变后的prf1基因序列如seq id no:1～seqid no:4所示。

21、在本发明一些实施方式中，所述nk细胞包括car-nk细胞。

22、在本发明一些实施方式中，所述nk细胞包括car-nk-92细胞。

23、本发明的第三个方面，提供一种prf1突变体，所述prf1突变体的核苷酸序列如seqid no:1～seq id no:4中任一序列所示。

24、在本发明一些实施方式中，在seq id no:1～seq id no:4的核苷酸序列存在prf1突变的基础上，还可以进行保守取代。其中一个类别的核苷酸被另一个相同类别的核苷酸取代，落在所公开的变体的范围内，只要该取代实质上不改变多肽的活性。保守取代对于本领域技术人员是众所周知的。

25、本发明的第四个方面，提供一种免疫细胞，所述免疫细胞携带有seq id no:1～seq id no:4中任一序列所示的prf1突变体的基因。

26、在本发明一些实施方式中，所述免疫细胞包括t细胞和/或nk细胞。

27、在本发明一些实施方式中，所述免疫细胞为nk细胞。

28、在本发明一些实施方式中，所述免疫细胞包括car-nk细胞。

29、本发明的第五个方面，提供本发明第三方面的prf1突变体或本发明第四方面的免疫细胞在制备抗肿瘤产品或制备提高对肿瘤细胞杀伤作用的产品中的应用。

30、在本发明一些实施方式中，所述产品包括但不限于试剂、试剂盒和药物。

31、在本发明一些实施方式中，所述产品为药物。

32、在本发明一些实施方式中，所述药物还包括其他药物和药学上可接受的载体，如赋形剂或稀释剂，并且所述载体可以包括非天然存在的载体。载体，赋形剂和稀释剂的例子包括乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，木糖醇，赤藓糖醇，麦芽糖醇，淀粉，阿拉伯树胶，藻酸盐，明胶，磷酸钙，硅酸钙，纤维素，甲基纤维素，微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，水，尼泊金乙酯，尼泊金丙酯，滑石，硬脂酸镁和矿物油。

33、在本发明一些实施方式中，所述药物根据常用方法的丸剂，散剂，颗粒剂，胶囊剂，混悬剂，溶液剂，乳剂，糖浆剂，灭菌水溶液，非水溶剂，混悬剂，乳剂，冻干制剂，透皮吸收剂，凝胶剂，洗剂，软膏剂，霜剂，贴剂，巴布剂，糊剂，喷雾剂，皮肤乳剂，皮肤混悬剂，透皮传递贴剂，含药绷带或栓剂。具体地，当配制时，药物可使用稀释剂或赋形剂制备，所述稀释剂或赋形剂例如常用的填料，重量剂，粘合剂，润湿剂，崩解剂和表面活性剂。口服给药的固体材料包括片剂，丸剂，散剂，颗粒剂，胶囊，但不限于此。这样的固体材料可以通过混合至少一种或多种赋形剂，例如淀粉，碳酸钙，蔗糖，乳糖，明胶等来制备。此外，除了简单的赋形剂外，还可以使用润滑剂如硬脂酸镁和滑石。除用于口服的液体和液体石蜡外，还可加入各种赋形剂，如润湿剂，甜味剂，香料，防腐剂等。胃肠外给药的制剂包括无菌水溶液，非水溶液，悬浮液，乳剂，冻干制剂和栓剂。丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄榄油，可注射酯如油酸乙酯等可用作非水溶剂和悬浮剂。witepsol，macrogol，tween 61，可可脂，月桂醇，甘油明胶等可用作栓剂的基质。

34、在本发明一些实施方式中，所述肿瘤包括但不限于脑癌，乳腺癌，宫颈癌，结肠癌，头颈部癌，肝癌，肾癌，肺癌，非小细胞肺癌，黑色素瘤，间皮瘤，卵巢癌，肉瘤，胃癌，子宫癌和成髓细胞瘤。

35、本发明的第六个方面，提供一种产品，本发明第三方面的prf1突变体或本发明第四方面的免疫细胞。

36、在本发明一些实施方式中，所述产品包括但不限于试剂、试剂盒和药物。

37、本发明的有益效果是：

38、本发明基于prf1基因的定向改造以提高car-nk细胞的杀伤活力，从而增强car-nk细胞疗法的疗效。具体地，本发明通过构建四种prf1突变型免疫细胞(分别为car-cd19-nk-92-nc、car-cd19-nk-92-prf1wt、car-cd19-nk-92-prf1c31y、car-cd19-nk-92-prf1g45v、car-cd19-nk-92-prf1g71v、car-cd19-nk-92-prf1c76s)，并进行杀伤活力的测定，结果显示，prf1基因的改造可显著增加car-nk细胞的靶细胞杀伤效果。将prf1突变型免疫细胞用于制备药物组合物可以用于癌症的治疗，具有极好的应用前景。