一种副球菌来源的酰胺酶及其突变体的应用

本发明属于酶催化，具体涉及一种副球菌paracoccus sp kdspl-02来源的酰化酶pa404w及其突变体pm-f274a/w404g的酰化反应及应用于6-apa及7-adca的酶法制备以及半合成类β-内酰胺类抗生素的合成中。

背景技术：

1、青霉素酰化酶属于氨基水解酶类，来源广泛(细菌、真菌和酵母)，是一种重要的工业用酶。青霉素酰化酶同时也是一种多功能酶，具有广泛的底物谱、高区域选择性、高化学选择性和高对映体选择性，能够催化多种反应。青霉素酰化酶在手性化学品合成中应用广泛，主要可以分为6-氨基青霉烷酸(6-apa)和7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(7-adca)的制备、半合成β-内酰胺抗生素的合成、甚至还包括手性化合物的拆分、前手性化合物的不对称水解和多肽合成5个方面。

2、6-apa和7-adca以及7-aca和7-acca等是半合成β-内酰胺抗生素的关键中间体，需求量大，它们的生产直接影响世界抗生素市场的稳定性。6-apa的传统化学法生产以发酵产物青霉素g为原料，反应条件苛刻，需要使用高毒试剂，会产生大量废物。6-apa的酶法生产同样以青霉素g为原料，通过青霉素酰化酶水解生成6-apa。随着新的青霉素酰化酶的发现，重组dna技术的运用以及固定化技术的发展，6-apa的酶法生产在20世纪80年代基本取代了化学法。时至今日，研究工作者仍然在发现新的青霉素酰化酶，酰化酶的定向进化，酶固定化技术等领域不断探索突破，以提高6-apa或7-aca的生产效率。

3、β-内酰胺类抗生素因其杀菌活性强、适应症广、毒性低、临床疗效好，成为临床上应用最广泛的抗菌药物。由于近年来致病菌耐药性的出现，削弱了传统抗生素的疗效，导致一系列β-内酰胺类抗生素退出临床，并促使半合成抗生素的开发与使用。在β-内酰胺类半合成抗生素的制备过程中，青霉素酰化酶(酰胺酶)扮演了重要的角色，其可水解青霉素g获得重要的中间体6-apa，并能有效的催化酰基转移(主要是d-苯基甘氨酸和对羟基-d-苯基甘氨酸残基从其酰胺和酯转移到青霉素和头孢菌素母核)。因此本发明中的副球菌来源的酰胺酶及其突变体在半合成抗生素工业领域具有较强的实用性。

4、近年来，酰化酶，特别是青霉素酰化酶在欧美的一些发达国家中需求量逐渐上升，而我国在微生物产青霉素酰化酶方面虽然与国外相比，正处于发展中阶段。这一领域的发展，其根本在于新来源的酰化酶不断发现，才有可能进一步获得更高效的突变体及配套生产工艺。

技术实现思路

1、本发明提供了一种副球菌来源的酰化酶pa404w及其突变体pm-f274a/w404g催化酰胺化反应及用于6-apa、7-aca以及7-adca中，以及用于相关半合成β-内酰胺类抗生素制备中。

2、本发明所述副球菌来源酰化酶pa404w及其突变体pm-f274a/w404g均由大肠杆菌工程菌株制备。

3、本发明提供了包含所述基因的表达盒、重组载体和重组转化子。

4、所述6-apa的酶法制备，即利用酶pa404w或其突变体pm-f274a/w404g催化青霉素g侧链水解，合成6-apa。

5、所述7-aca的酶法制备，即利用酶pa404w或其突变体pm-f274a/w404g催化头孢霉素c侧链水解，合成7-aca。

6、所述7-adca的制备，即利用酶pa404w和pm-f274a/w404g对青霉素g扩环产物头孢g酸(7-苯乙酰氨基去乙酰氧基头孢g酸，7paadca)的侧链酰胺的水解，以生成7-adca。

7、所述相关半合成β-内酰胺类抗生素的合成，即利用酶pa404w和pm-f274a/w404g对6-apa(或7-adca)与氨基侧链(如d-苯甘氨酸甲酯或d-对羟基苯甘氨酸甲酯)进行缩合反应。

8、本领域普通技术人员根据本发明提供的酰胺酶的氨基酸序列，可以方便地进行重组获得基因工程菌，以基因工程菌发酵培养获得的菌体细胞或菌体细胞破碎后的上清液或者纯化后的酶液作为酶源。

9、本发明的副球菌来源的酰胺酶及其突变体的应用的有益效果为：

10、本发明研究人员在前期研究中筛选得到一株高效水解青霉素的菌株，即paracoccus sp.kdspl-02，提示在该菌中，具有高效水解青霉素的酶。本发明利用生物信息学技术从paracoccus sp.kdspl-02中挖掘得到酰化酶的编码基因。本发明将副球菌酰化酶序列克隆至大肠杆菌中，对重组菌株进行优化，得到高表达副球菌来源酰化酶的工程菌株，制备酰化酶，并利用该酶进行青霉素或头孢菌素的水解生成重要的药物中间体6-apa、7-aca及7-adca，为上述重要药物中间体的制备提供了新的生物催化剂选择。

11、本发明从副球菌中鉴定出新的编码酰化酶的序列，具备新颖性。其可应用于重要的抗生素工业中间体6-apa、7-aca以及7-adca的制备，以及相关半合成β-内酰胺类抗生素的合成中。

技术特征：

1.一种副球菌来源的酰胺酶及其突变体的应用，其特征在于，所述应用为利用酰胺酶或其突变体催化酰胺化反应，所述副球菌为副球菌paracoccussp.kdspl-02。

2.根据权利要求1所述的一种副球菌来源的酰胺酶及其突变体的应用，其特征在于，所述酰胺酶的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述突变体的氨基酸序列如seq id no.2所示。

3.根据权利要求1或2所述的一种副球菌来源的酰胺酶及其突变体的应用，其特征在于，所述应用为利用酰胺酶或其突变体催化青霉素g侧链水解，合成6-apa。

4.根据权利要求1或2所述的一种副球菌来源的酰胺酶及其突变体的应用，其特征在于，所述应用为利用酰胺酶或其突变体催化头孢霉素c侧链水解，合成7-aca。

5.根据权利要求1或2所述的一种副球菌来源的酰胺酶及其突变体的应用，其特征在于，所述应用为在化学合成7-adca或7-acca母核过程中利用酰胺酶或其突变体催化侧链酰胺的水解。

6.根据权利要求1或2所述的一种副球菌来源的酰胺酶及其突变体的应用，其特征在于，所述应用为利用酰胺酶或其突变体催化6-apa的氨基与不同半合成抗生素侧链缩合，合成相关半合成青霉素类β-内酰胺抗生素。

7.根据权利要求1或2所述的一种副球菌来源的酰胺酶及其突变体的应用，其特征在于，所述应用为利用酰胺酶或其突变体催化7-aca、7-adca或7-acca的氨基与不同半合成抗生素侧链缩合，合成相关半合成头孢菌素类β-内酰胺抗生素。

8.根据权利要求1或2所述的一种副球菌来源的酰胺酶及其突变体的应用，其特征在于，所述应用为利用酰胺酶或其突变体催化6-apa的氨基与d-苯甘氨酸甲酯缩合，合成氨苄西林；或催化6-apa的氨基与d-对羟基苯甘氨酸甲酯缩合，合成阿莫西林。

9.根据权利要求1或2所述的一种副球菌来源的酰胺酶及其突变体的应用，其特征在于，所述应用为利用酰胺酶或其突变体催化7-adca的氨基与d-苯甘氨酸甲酯缩合，合成头孢氨苄；或催化7-adca的氨基与d-对羟基苯甘氨酸甲酯缩合，合成头孢羟氨苄。

技术总结本发明公开了一种副球菌来源的酰胺酶及其突变体的应用，所述酰化酶为来自于副球菌Paracoccus sp.KDSPL‑02的酰胺酶Pa404W和突变酶Pm‑F274A/W404G。本发明所述酰化酶Pa404W及其突变体Pm‑F274A/W404G催化酰胺化的应用，涉及到利用酰化酶Pa404W和突变酶Pm‑F274A/W404G催化水解β‑内酰胺类抗生素包括青霉素类(如青霉素G、青霉素V、青霉亚砜、阿莫西林、苯唑西林钠等)以及头孢菌素类(如：头孢噻吩、头孢氨苄、头孢唑林等)，可实现侧链与母核之间酰胺键完全水解，产生6‑氨基青霉烷酸(6‑APA)以及7‑氨基去乙酰氧基头孢烷酸(7‑ADCA)。同时，Pa404W及Pm‑F274A/W404G也能催化6‑APA与D‑苯基甘氨酸甲酯或对羟基‑D‑苯基甘氨酸甲酯发生反应，实现6‑APA和7‑ADCA以及7‑ACA氨基上的酰化。技术研发人员：刘守信,沈辰,丛芹芹,谭可,王永发受保护的技术使用者：河北科技大学技术研发日：技术公布日：2024/6/18