一种由改进的piggyBac转座子介导的基因整合方法及其应用

本发明专利涉及基因工程，具体而言，涉及一种由改进的piggybac转座子介导的基因整合方法及其应用。

背景技术：

1、将外源dna片段整合到宿主细胞的基因组中是生物技术领域的一项重要技术，在细胞株(系)改造、构建各种转基因动物和基因治疗等领域有非常重要的应用。在细胞株(系)改造领域，外源基因整合能力是获得稳定细胞株的技术保障。获取稳定细胞株的操作步骤繁琐，周期长，至少需要3个月才能完成。而且经常不能筛选到特别满意的稳定细胞株。因此，提高外源基因整合能力一直是该领域的首要考虑因素。在构建各种转基因动物领域，外源基因整合的效率直接影响转基因动物的成功与否。只有成功在动物的受精卵或胚胎期整合入宿主动物的基因组，才能获得所需要的转基因动物。在基因治疗领域，安全、有效地导入对治疗有价值的基因或失活致病基因(如突变的基因)，是基因治疗技术的关键。载体的整合能力和整合“安全性”一直是该技术的核心。除了提高载体的整合能力，整合“安全性”也是该技术必须考虑的。因为导入细胞内的dna由于整合到基因组上的“沉默区”引起导入的目的基因被“沉默”不能表达而导致整合失败，或者整合到不该整合宿主细胞的基因组位置导致一个重要基因被破坏。

2、按照目的基因插入基因组内的整合方式分为随机整合和定点整合两种。(1)慢病毒等介导的基因整合方式属于随机整合。慢病毒介导的基因整合效率可高达10％，但是操作者若不注意会存在被病毒感染的风险，因此需要在特殊的实验环境下进行。另外，慢病毒介导的基因整合除了构建相应载体外，还需要包装病毒获取高滴度的病毒等，操作繁琐，容易失败。(2)归巢内切酶i-scei、talen和crispr/cas9等基因编辑系统介导的基因整合方式属于定点整合。归巢内切酶i-scei的整合效率约0.02％～2％，但是归巢内切酶在基因组上可用的切割位点比较少，只能在有限位点进行定点整合，极大限制了其应用。talen和crispr/cas9等基因编辑工具可以提高效率达5％～20％。但是，所有定点整合的基因编辑工具均存在一个问题：定点插入的载体需要根据插入位点进行专门的载体设计与构建，意味着每进行一个新的位点定向整合就需要重新构建一次“打靶”载体，这给操作者带来不少的工作量，而且有时候某位点的整合效率特别低或整合入该位点的外源基因表达效率低。

3、转座子，又名转座因子是一类在基因组内可以“跳跃、移动”的遗传因子。与sleepingbeauty转座子、tol2转座子相比，piggybac转座子(简称pb转座子)具有更广泛的转座活性，较少地依赖于宿主因子即可实现高效转座。pb转座子的转座功能是由一个含有594个氨基酸残基的转座酶pbase介导的。该酶是在细胞质中表达成熟，而pbase介导的转座在细胞核内进行。核膜将真核细胞内的空间分隔为细胞核和细胞质2个不同的区域。核膜是不连续的，其上存在很多小孔。这些小孔结构本质上为核孔复合物(nuclearpore complex，npc)，是细胞质和细胞核之间来回运输物质的通道。因此，pbase转座酶需要“穿越”核孔才能到达其发挥作用的部位——细胞核。核定位信号(nuclear localization signal，nls)是蛋白质的一个结构域，能够与核转运蛋白相互作用，将蛋白通过核孔运进细胞核。第一个被确认的nls来自病毒sv40的t抗原(sv40-nls)。研究证实sv40-nls具有很强的核定位能力，不少科学家尝试开发它的应用，譬如用于构建人工合成的分子生物转运工具等。

4、综上所述，本发明旨在提供一种由改进的piggybac转座子介导的基因整合方法及其应用，以解决上述问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于解决背景技术中提出的技术问题，提供一种由改进的piggybac转座子介导的基因整合方法及其应用。

2、本发明的目的通过以下技术方案实现：

3、一种由改进的piggybac转座子介导的基因整合方法，所述方法包括以下步骤：

4、s1、高效piggybac转座系统的构建，即通用载体系统的构建：

5、通用载体系统包含供体载体和辅助载体，其中，供体载体：包括piggybac转座子5’重复末端序列5’tr和3’重复末端序列3’tr，在5’tr和3’tr之间设有多克隆位点；辅助载体：包括改造后的piggybac转座酶编码基因epbase，在epbase的上游设有能提高翻译起始的元件、高效启动子，在其下游设有更加有效的终止转录的ploya；

6、s2、利用高效piggybac转座系统建立稳转细胞系/株、转基因动物以及在基因治疗中应用：

7、(1)构建新型piggybac介导的稳转细胞细胞系的载体系统，在新霉素抗性基因表达框的5端和3端分别插入pbase识别的左右臂，获得筛选载体pb(neor)；pb转座子的转座通过其编码的转座酶pbase实现；然后再直接通过pcr从质粒mahelppiga3上扩增得到pb转座酶pbase，组装入pcdna3.1载体得到由广谱表达的启动子cmv驱动的pbase表达系统；并在pbase的3端或5端分别插入高效核定位信号肽sv40-nls；

8、(2)使用lipofectamine2000将上述载体转染细胞以验证其他的效果；其中，细胞共分为4组：pcdna3.1/pb(neor)；pcdna3.1-pbase/pb(neor)；pcdna3.1-5nlspbase/pb(neor)和pcdna3.1-3nlspbase/pb(neor)；将3种cmv启动子驱动的pb转座酶表达载体分别和环形质粒形式的pb在质量比1∶2的比例下混合，分别得到pcdna3.1-pbase/pb，pcdna3.1-5nlspbase/pb和pcdna3.1-3nlspbase/pb这3种pb转座酶介导的转座系统进行细胞转染。

9、进一步地，所述转座系统应用于获取转基因小鼠，具体应用方法为：

10、高效piggybac转座系统获取转基因小鼠：

11、先构建有关转基因载体-携带有目的基因的pb供体载体和由cmv启动子驱动的pb转座酶表达的辅助载体，上述载体以环形质粒形式，在质量比1：2的比例下，进行小鼠受精卵雄原核dna显微注射，注射后的受精卵移植到假孕小鼠生殖系统中，使其怀孕并获得新生小鼠，采集新生小鼠尾尖，提取dna后，利用pcr进行鉴定，得到pb转基因阳性的转基因小鼠。

12、进一步地，所述转座系统应用于获取转基因斑马鱼，具体应用方法为：

13、高效piggybac转座系统获取转基因斑马鱼：

14、(1)获取斑马鱼的载体系统：通过构建在肌肉中特异表达egfp的标志基因来筛查转基因斑马鱼阳性，构建pb(pmylz2(eg))供体载体；并构建在斑马鱼中在合子期稳定表达的3’pbase的辅助载体；

15、(2)然后，将上述载体按1：2的比例溶于0.1m ph为7.5～7.6的tris-hcl缓冲液中，然后调节浓度50ng/ul。

16、进一步地，将pb(pmylz2(eg))供体载体和3’pbase的辅助载体溶于tris-hcl缓冲液后进行注射，且注射部位为：针从植物极扎入，且靠近动物极；且注射的卵的状态为单个细胞或2个细胞期的胚胎以获取转基因斑马鱼。

17、进一步地，所述转座系统应用于基因治疗，具体应用方法为：

18、(1)获取用于基因治疗领域的载体系统：将对治疗有价值的基因或失活致病基因如(突变的基因)插入s1所述的供体载体中；并构建在目的细胞/器官中特异稳定表达3’pbase的辅助载体或直接使用广谱启动子驱动的3’pbase的辅助载体；

19、(2)将上述载体按1：2的通过常规的转染方法导入目的细胞/器官。

20、本发明解决技术问题的难度及意义在于：

21、针对克服现有技术中目的基因插入基因组内的整合方式中的随机整合和定点整合两种整合方式的缺陷问题，本发明的方案通过将现有的pb转座子进行改造提高其整合基因组的能力，因此，本发明的技术方案不但整合编辑工具效率高，而且只需构建一种载体即可整合到宿主细胞的基因组在不同位点，利于一次性高效地筛选到最佳整合位点的克隆；另外，还可以通过反向pcr(reverse-pcr)技术鉴定出插入位点。由此可见，本发明的技术方案由pb介导基因整合的策略具有效率高、操作简单、位点易鉴定等优势。

22、综上所述，与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：

23、1、通过本发明的方法，利用构建的高效piggybac转座系统在不同细胞系测试，其介导的克隆形成能力能够提高9-40倍；转基因小鼠的阳性率达50％，转基因斑马鱼的阳性率也很高，且基因表达十分稳定；

24、2、通过本发明的方法构建的piggybac系统介导基因组整合方法，其具有效率高、操作简单、位点易鉴定等优势。