一株用于左旋肉碱生产的大肠杆菌突变体及其应用

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一株用于左旋肉碱生产的大肠杆菌突变体及其应用。

背景技术：

1、左旋肉碱是一种存在于生命体中特别是动物肌肉组织中高浓度存在的季胺化合物，以其突出的脂肪代谢功能引起了广泛的研究。在细菌中，肉碱可以作为最终的电子受体、相容的溶质、唯一的碳源和氮源，以及渗透压保护剂。哺乳动物中左旋肉碱主要参与脂肪代谢、释放能量，它辅助激活形态的长链脂肪酸从细胞质基质中运到到线粒体基质发生β氧化。人体中95％的左旋肉碱存在于骨骼肌和心肌中，剩下的5％在血液系统中循环。

2、左旋肉碱在食品工业、饲料工业、医药工业等领域都有着非常广泛的应用。由于左旋肉碱重要的脂肪代谢能力，被用作瘦身减肥产品的主要有效成分，同时对于婴儿脑部发育至关重要；研究表明左旋肉碱具有提高身体耐受性、提高肌肉量、降低血脂、强心等功能，所以左旋肉碱也在运动食品、老年保健品与家禽家畜的养殖及牲畜饲料中被广泛添加；在医药工业中，左旋肉碱可用于治疗尿毒症贫血，缓解内毒素血症保护肝脏受损，提高精子活力和治疗女性不孕症等，得到了全世界医药行业的密切关注，并不断开发应用到各种疾病治疗当中。因此，左旋肉碱具有广泛的应用前景和较高的商业价值。

3、目前国内外常见的左旋肉碱的合成主要有两种：一是微生物发酵生产法，二是化学催化法，利用不对称原料手性催化合成左旋肉碱，并将其与副产物右旋肉碱分离，这也是目前化学方法合成左旋肉碱的主流方法。尽管化学合成左旋肉碱纯度高，便于分离，但是其对原料要求苛刻、步骤繁琐、操作困难等缺陷仍有待改善。生物法具有绿色高效的特点，适合工业生产。

4、中国科学院微生物研究所构建了重组大肠杆菌用于生产左旋肉碱(产左旋肉碱的重组菌及其构建方法与应用.zl201811252374.7.)，该重组大肠杆菌菌株生长需要富营养培养基(含蛋白胨、酵母膏等)才能生长，菌株不能在无机盐培养基中生长，导致发酵成本较高。为了降低发酵成本，在工业规模化生长中，往往采用低廉的无机盐培养基。因此迫切需要开发一种能在无机盐培养基中生长并且能产生左旋肉碱的微生物。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何使微生物在无机盐培养基中生长并且能产生左旋肉碱。

2、本发明的一个目的是提供一种产左旋肉碱的生产菌株，以及一种制备左旋肉碱的方法。

3、本发明提供了一种制备左旋肉碱的方法，包括用培养基培养重组大肠杆菌，得到发酵产物，从所述发酵产物中得到左旋肉碱，所述重组大肠杆菌为大肠埃希氏菌(escherichia coli)car10，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为cgmcc no.25408。

4、上述方法中，所述培养基由发酵培养基、流加物a、流加物b和流加物c组成，所述发酵培养基不含有机氮源，所述流加物a为葡萄糖溶液，所述流加物b为l-阿拉伯糖溶液，所述流加物c为γ-丁基甜菜碱盐酸盐(又叫丁基甜菜碱盐酸盐)溶液。

5、上述方法中，所述发酵培养基由无机盐、葡萄糖、维生素b1、消泡剂和水组成。

6、上述方法中，所述无机盐由磷酸二氢钾、十二水合磷酸氢二钠、硫酸铵和七水合硫酸镁组成。

7、所述葡萄糖：γ-丁基甜菜碱添加比例为1:0.1-10；所述葡萄糖：γ-丁基甜菜碱底物流加速度为5-100mm/h。

8、上述方法中，所述发酵培养基的组成为磷酸二氢钾1.6g/l；十二水合磷酸氢二钠8.6g/l；硫酸铵2g/l；七水合硫酸镁0.6g/l；葡萄糖20g/l；维生素b1 4.5mg/l；聚醚类消泡剂1ml/l，其余为水。

9、上述方法中，所述培养包括先用所述发酵培养基培养所述重组大肠杆菌，然后向培养体系中流加所述流加物b进行诱导表达，并向所述培养体系中加入所述流加物c；待所述培养体系中的葡萄糖消耗完毕时，向所述培养体系中流加所述流加物a。

10、上述方法中，所述流加物c的流加速度为每升培养体系中流加5-100mmol/h，所述流加物a的速度满足所述培养体系中的葡萄糖和γ-丁基甜菜碱盐酸盐的配比为1g葡萄糖：0.1-10mmolγ-丁基甜菜碱盐酸盐。

11、本发明还提供了一种重组大肠杆菌，所述大肠杆菌为大肠埃希氏菌escherichiacoli car10，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为cgmcc no.25408。

12、上述制备方法和所述的重组大肠杆菌在制备左旋肉碱中的应用也属于本发明要求保护的范围。

13、本发明通过进化获得一株突变菌株，该突变菌株可以采用无机盐培养基发酵，从而降低了发酵成本，并通过生产工艺的建立和优化，提高了左旋肉碱的产量。本技术优势：所有的种子培养基均为化学成分确定的培养基，该培养基成本低廉，不含有任何有机态氮源，如酵母浸提物、蛋白胨等。本方法建立的左旋肉碱生产工艺，使菌体左旋肉碱产量及产率均大大提高，克服了生物方法合成左旋肉碱的低纯度、低产量的技术障碍。

14、保藏说明

15、菌种名称：大肠埃希氏菌

16、拉丁名：escherichia coli

17、菌株编号：car10

18、保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

19、保藏机构简称：cgmcc

20、地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

21、保藏日期：2022年07月26日

22、保藏中心登记入册编号：cgmcc no.25408

技术特征：

1.制备左旋肉碱的方法，其特征在于，所述方法包括用培养基培养重组大肠杆菌，得到发酵产物，从所述发酵产物中得到左旋肉碱，所述重组大肠杆菌为大肠埃希氏菌(escherichia coli)car10，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为cgmcc no.25408。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述培养基由发酵培养基、流加物a、流加物b和流加物c组成，所述发酵培养基不含有机氮源，所述流加物a为葡萄糖溶液，所述流加物b为l-阿拉伯糖溶液，所述流加物c为γ-丁基甜菜碱盐酸盐溶液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基由无机盐、葡萄糖、维生素b1和水组成。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述无机盐由磷酸二氢钾、十二水合磷酸氢二钠、硫酸铵和七水合硫酸镁组成。

5.根据权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基的组成为磷酸二氢钾1.6g/l；十二水合磷酸氢二钠8.6g/l；硫酸铵2g/l；七水合硫酸镁0.6g/l；葡萄糖20g/l；维生素b1 4.5mg/l，其余为水。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于，

7.重组大肠杆菌，所述大肠杆菌为大肠埃希氏菌escherichia coli car10，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为cgmcc no.25408。

8.权利要求1-6中任一所述的方法、权利要求7中所述的重组大肠杆菌在制备左旋肉碱中的应用。

技术总结本发明公开了一株用于左旋肉碱生产的大肠杆菌突变体及其应用。本发明涉及生物工程领域，具体涉及一株用于左旋肉碱生产的大肠杆菌突变体及其应用。本发明采用低廉的无机盐培养基培养重组大肠杆菌，得到发酵产物，从发酵产物中得到左旋肉碱。其中重组大肠杆菌为大肠埃希氏菌Escherichia coli Car10，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.25408。采用无机盐培养基发酵Car10，降低了发酵成本，通过发酵生产工艺的建立和优化，提高了左旋肉碱的产量，具有很高的生产应用价值。技术研发人员：林白雪,刘洁铮,周航,陶勇受保护的技术使用者：中国科学院微生物研究所技术研发日：技术公布日：2024/6/18