一株高产β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌及其应用

本发明属于生物工程，具体涉及一株高产β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌及其应用。

背景技术：

1、β-甘露聚糖酶(endo-1，4-β-mannanase；ec3.2.1.78)，简称甘露聚糖酶。甘露聚糖酶是作用于甘露聚糖中β-1，4-糖苷键，释放甘露寡糖的关键酶，属于半纤维素酶类。甘露聚糖是以d-甘露糖为主要单体的半纤维素，是植物细胞壁的重要组成部分，主要有半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳葡萄甘露聚糖等形式。甘露聚糖酶在自然界中的来源非常丰富，可由多种微生物、植物和动物产生。细菌、真菌、放线菌等微生物是产生甘露聚糖酶的主要来源。已报道的如细菌中的芽孢杆菌、假单胞菌、弧菌，真菌里的曲霉、木霉、酵母，放线菌中的链霉菌等都是产甘露聚糖酶的常见类群。根据氨基酸序列的相似性，β-甘露聚糖酶主要被划分为gh5和gh26家族，少数成员位于gh113和134家族。

2、研究表明，甘露聚糖酶一般以胞外诱导酶的形式存在于生物体中，当在培养基中添加少量的甘露聚糖或甘露寡糖(如角豆胶、槐豆胶或其水解物等)，可以起到促进产酶的作用。槐豆胶是一种半乳甘露聚糖，由四分子半乳糖和一分子甘露糖为单元组成。槐豆胶主要由来源于地中海的刺槐树种子加工而成，其来源广泛价格便宜，半乳甘露聚糖含量高，是目前微生物发酵产酶生产中使用较为广泛的碳源。

3、2020年金曼等人通过丙酮沉淀、阴离子交换柱层析、凝胶过滤层析等方法相结合获取甘露聚糖纯酶，丙酮沉淀酶活提取率高达99.13％，最终纯化倍数达到19.32。2023年poulsen等人的研究中显示高甘露聚糖饲料会对动物肠道状况产生不利影响，而在日粮中添加甘露聚糖酶可显著缓解高甘露聚饲料对微生物群组成的负面影响，改善动物肠道健康状况。各国越来越多地使用木质纤维素农业残留物(如大豆壳、棕榈粕)的酶糖化来获得用于生物技术过程的可发酵糖，许多微生物已被用于木质纤维素生物质的分解。甘露寡糖在饲料业中的需求也越来越大，如何高效的获得甘露寡糖日益受到科研工作者的关注，而甘露寡糖的制备与甘露聚糖酶的酶活及其作用条件有着密切的关系。因此，国内外学者进行了大量产甘露聚糖酶野生型菌种的筛选、培育诱导，但仍缺乏高酶活的野生型菌株。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一株高产β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，解决了制备甘露寡糖时酶活低的问题。

2、本发明所采用的技术方案如下：一株高产β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m20232441，分类命名为bacillus subtilis bsm1，保藏日期为2023年12月04日，该菌株为革兰氏阳性菌，菌落形态为圆形，表面干燥，粗糙似毛玻璃状，边缘似拓展状，能水解淀粉，能耐浓度为7％的nacl生长，硝酸盐还原、过氧化氢酶测定、v.p实验、明胶液化结果为阳性，糖发酵实验(d-木糖、l-阿拉伯糖、d-甘露醇)、甲基红实验、柠檬酸盐及丙酸盐利用结果为阴性。

3、本发明还提供了如上所述的一株高产β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌的培养方法，如下：取od600nm＝1.0种子液按体积比1％的接种量接种至lb培养基中，温度20-55℃，ph＝5-10，220r/min条件下培养6-12h。

4、进一步的，如上所述的培养方法，优选温度37-50℃，ph＝6-8。

5、本发明还提供了如上所述的一株高产β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌生产甘露聚糖酶的方法，其特征在于，取od600nm＝1.0种子液按体积比1％的接种量接种至lb培养基中，ph＝6-8，220r/min，37-50℃，培养24h，再以体积比2％的比例接种至发酵培养基中，ph＝6-8，220r/min，37-55℃，培养5天，从第48h起每隔24h取发酵液，8000r/min离心15min取上清液作为甘露聚糖粗酶液，dns法测定酶活，产酶高峰为第96h，酶活性为49.067u/ml；其中，所述的发酵培养基配方如下：槐豆胶10.0g/l，蛋白胨5.0g/l，磷酸二氢钾1g/l，七水硫酸镁0.2g/l，氯化钠5g/l。

6、本发明还提供了如上所述的一株高产β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌生产甘露聚糖酶的方法，优选温度45℃，ph＝8。

7、本发明还提供了如上所述的一株高产β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌作为发酵剂在对棕榈粕进行固态发酵中的应用。

8、本发明还提供了如上所述的一株高产β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌的固态发酵的方法，如下：按固液比：向100g棕榈粕中添加菌液9ml，菌液od600nm＝1.0-1.2，再添加无菌水40ml，保持恒温32℃，密闭发酵时间为2天。发酵后棕榈粕的营养价值得到明显改善，半纤维素降解效果良好，还原糖与总糖含量显著增加。

9、本发明的优点及有益效果：采用本发明的菌株进行液体发酵生产β-甘露聚糖酶，可使甘露聚糖酶活在96h时达到49.067u/ml。利用本发明菌株对棕榈粕进行固态发酵，发酵后棕榈粕的营养价值得到明显改善，半纤维素降解效果良好，还原糖与总糖含量显著增加。因此，本菌株在甘露聚糖酶的制备及发酵饲料生产领域具有较好的应用前景。

技术特征：

1.一株高产β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 20232441，分类命名为bacillus subtilis bsm1。

2.根据权利要求1所述的一株高产β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，取od600nm＝1.0种子液按体积比1％的接种量接种至lb培养基中，温度20-55℃，ph＝5-10，220r/min，培养6-12h。

3.根据权利要求2所述的一株高产β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，温度37-50℃，ph＝6-8。

4.根据权利要求1所述的一株高产β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌生产甘露聚糖酶的方法，其特征在于，取od600nm＝1.0种子液按体积比1％的接种量接种至lb培养基中，ph＝6-8，220r/min，37-50℃，培养24h，再以体积比2％的比例接种至发酵培养基中，ph＝6-8，220r/min，37-55℃，培养5天，从第48h起每隔24h取发酵液，8000r/min离心15min取上清液作为甘露聚糖粗酶液，dns法测定酶活，产酶高峰为第96h，酶活性为49.067u/ml；其中，所述的发酵培养基配方如下：槐豆胶10.0g/l，蛋白胨5.0g/l，磷酸二氢钾1g/l，七水硫酸镁0.2g/l，氯化钠5g/l。

5.根据权利要求4所述的一株高产β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌生产甘露聚糖酶的方法，其特征在于，温度45℃，ph＝8。

6.根据权利要求1所述的一株高产β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌作为发酵剂在对棕榈粕进行固态发酵中的应用。

7.根据权利要求1所述的一株高产β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌的固态发酵的方法，其特征在于，方法如下：按固液比：向100g棕榈粕中添加菌液9ml，菌液od600nm＝1.0-1.2，再添加无菌水40ml，保持恒温32℃，密闭发酵时间为2天。

技术总结本发明公开一株高产β‑甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。本发明的枯草芽孢杆菌，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 20232441，分类命名为Bacillus subtilis BSM1。本发明还公开了所述的枯草芽孢杆菌的固态发酵的方法，如下：按固液比：向100g棕榈粕中添加菌液9ml，菌液OD<subgt;600nm</subgt;＝1.0‑1.2，再添加无菌水40ml，保持恒温32℃，密闭发酵时间为2天。发酵后棕榈粕的营养价值得到明显改善，半纤维素降解效果良好，还原糖与总糖含量显著增加。本菌株在甘露聚糖酶的制备及发酵饲料生产领域具有较好的应用前景。技术研发人员：石宝明,魏新柯,商婷婷受保护的技术使用者：东北农业大学技术研发日：技术公布日：2024/6/18