望春玉兰内小白菊内酯含量相关的分子标记及其应用

本发明属于植物分子生物学领域，涉及一种望春玉兰内小白菊内酯含量相关的分子标记及其应用。

背景技术：

1、近年来，中国学者利用小白菊内酯，经过化学改造开发了具有原创性的抗脑胶质瘤候选新药act001，该药能够进入人体脑部，治疗胶质母细胞瘤(ding et al.2020)。如世界医学难题——脑胶质瘤患者经过该药单药治疗，从仅有3个月生存期延长至今已超3年(图1)。act001治疗脑胶质瘤临床二期试验，在美国德州大学md安德森癌症中心开展，先后获得了美国与欧盟治疗胶质母细胞瘤的孤儿药资格。目前，中国国家药监局也快速批准了该药的联合放疗治疗实体瘤脑转移的临床试验，该药一旦上市则对原料小白菊内酯需求量巨大。

2、小白菊内酯(parthenolide，ptl)最早是从甘菊的花中提取的，其分子式为c15h20o3，相对分子质量为248.3。之前研究表明，小白菊内酯在甘菊的花中含量最高，叶片含量较少，根中几乎检测不到含量，但不同品种和不同倍性甘菊花中小白菊内酯含量仅为0.2％～0.5％(majdi et al.,2013)。合成化学的发展为很多药物生产提供了新途径，但是小白菊内酯化学合成需要13步化学反应，操作复杂且成本较高(freund&arndt,2016)。

3、大量研究表明，木兰科含笑属和玉兰属植物中也含有小白菊内酯(夏伟等,2014)。周倩等对木兰科八种植物叶片小白菊内酯含量测定，叶片小白菊内酯含量范围在0.002％～0.35％(周倩等,2022)。项目团队经过多年的研究发现小白菊内酯在望春玉兰根系中含量较高，且在自然群体中存在丰富的遗传变异，变异范围在0.25％～5.86％之间，最高含量个体是周倩等测定8种木兰科植物中含量最高的18倍。这为选育高含量小白菊内酯的林木新品种提供了契机。然而望春玉兰根系中小白菊内酯含量是一个逐渐积累的过程，一般需要四年才能达到稳定。而根系小白菊含量的高和低难以通过形态学来判别。如果以收获望春玉兰根皮提取小白菊内酯为目的的林业生产，一旦误用了含量低的无性系，将给生产者带来重大的损失。而植物的表型都是受基因型控制的，利用表型数据和基因型进行关联分析，筛选控制表型形状的关键区间，同时开发表型紧密连锁的分子标记可以在苗期通过基因型的鉴定来预判栽培后的望春玉兰根皮小白菊内酯含量。但目前还没有用于根系小白菊内酯早期鉴定的相关基因及引物。因此筛选出小白菊内酯含量关联的引物，是进行高含量小白菊内酯望春玉兰无性系早期选择及保证造林望春玉兰均为小白菊内酯含量高的无性系提供基础。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的第一目的是提供了一种可在早期快速鉴定望春玉兰内小白菊内酯含量相关的分子标记及其应用。本发明的第二目的是提供了一种检测上述分子标记的引物组合及试剂盒。本发明的第三目的是提供了一种鉴定望春玉兰内小白菊内酯含量的方法。

2、技术方案：本发明所述的望春玉兰内小白菊内酯含量相关的分子标记，所述分子标记包括mbi13_11039065和mbi13_11193126中的至少一种；mbi13_11039065为13号染色体第11039065位碱基，该位点存在三种基因分型，分别为g/g、a/a和a/g；mbi13_11193126为13号染色体第11193126位碱基，该位点存在三种基因分型，分别为c/c、t/t和c/t。

3、其中，当mbi13_11039065位点的基因分型为纯合g/g时，则该望春玉兰不含有小白菊内酯或者含量低于0.5％，当mbi13_11039065位点的基因分型为纯合a/a或者杂合a/g时，则该望春玉兰小白菊内酯含量高于3.0％；当mbi13_11193126位点的基因分型为纯合c/c时，则该望春玉兰不含有小白菊内酯或者含量低于0.5％，当mbi13_11193126位点的基因分型为纯合t/t或者杂合c/t时，则该望春玉兰小白菊内酯含量高于3.0％。

4、本发明所述的荧光定量pcr检测引物组合，所述引物组合包括检测mbi13_11039065和/或mbi13_11193126分子标记的引物对；所述检测mbi13_11039065分子标记的引物对包括核苷酸序列如seq id no.1～2所示的正向引物，以及核苷酸序列如seq idno.3所示的通用反向引物；检测mbi13_11193126分子标记的引物对包括核苷酸序列如seq idno.4～5所示的正向引物，以及核苷酸序列如seq id no.6所示的通用反向引物。

5、本发明所述的试剂盒，所述试剂盒含有上述的荧光定量pcr检测引物组合。其中，所述试剂盒内还包含2×castpcr genotyping master mix和ddh2o。本发明所述的分子标记、引物组合和试剂盒在鉴定望春玉兰内小白菊内酯含量中的应用。

6、本发明所述的鉴定望春玉兰内小白菊内酯含量的方法，包括以下步骤：提取待测望春玉兰的基因组dna；以提取的望春玉兰基因组dna为模板，利用上述的snp分子标记mbi13_11039065和mbi13_11193126的引物组合对进行荧光定量pcr扩增，若mbi13_11039065扩增产物中为纯合g/g位点，则所述望春玉兰不含有小白菊内酯或者含量低于0.5％；若mbi13_11039065扩增产物中为纯合a/a或者杂合a/g位点，则所述待测望春玉兰小白菊内酯含量高于3.0％；若mbi13_11193126扩增产物中为纯合c/c位点，则所述望春玉兰不含有小白菊内酯或者含量低于0.5％；若mbi13_11039065扩增产物中为纯合t/t或者杂合c/t位点，则所述待测望春玉兰小白菊内酯含量高于3.0％。

7、其中，所述荧光定量pcr的反应体系包括2×castpcr genotyping master mix、引物组合和ddh2o。

8、具体地，pcr反应体系为：每20μl体系中，2×castpcr genotyping mastermix10.0μl，30ng/μl dna模板2μl，10μm allele1和allele2引物各0.3μl，10μm通用反向引物0.8μl，ddh2o 6.6μl。

9、其中，所述荧光定量pcr的扩增程序为94℃预变性15min；94℃变性20s，62℃退火-延伸60s，共10个循环，每个循环结束后退火温度降低0.6℃；94℃变性20s，56℃退火-延伸60s，共30个循环；37℃1min。

10、本发明所述的分子标记在高含量小白菊内酯的望春玉兰育种中的应用。

11、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下突出的显著优点：本发明所开发的分子标记mbi13_11039065和mbi13_11193126，可以在早期对望春玉兰根皮小白菊内酯含量进行鉴定，可应用于高含量小白菊内酯的望春玉兰育种和造林优良苗木的选择。

技术特征：

1.望春玉兰内小白菊内酯含量相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记包括mbi13_11039065和mbi13_11193126中的至少一种；mbi13_11039065为13号染色体第11039065位碱基，该位点存在三种基因分型，分别为g/g、a/a和a/g；mbi13_11193126为13号染色体第11193126位碱基，该位点存在三种基因分型，分别为c/c、t/t和c/t。

2.根据权利要求1所述的望春玉兰内小白菊内酯含量相关的分子标记，其特征在于，当mbi13_11039065位点的基因分型为纯合g/g时，则该望春玉兰不含有小白菊内酯或者含量低于0.5％，当mbi13_11039065位点的基因分型为纯合a/a或者杂合a/g时，则该望春玉兰小白菊内酯含量高于3.0％；当mbi13_11193126位点的基因分型为纯合c/c时，则该望春玉兰不含有小白菊内酯或者含量低于0.5％，当mbi13_11193126位点的基因分型为纯合t/t或者杂合c/t时，则该望春玉兰小白菊内酯含量高于3.0％。

3.一种荧光定量pcr检测引物组合，其特征在于，所述引物组合包括检测mbi13_11039065和/或mbi13_11193126分子标记的引物对；所述检测mbi13_11039065分子标记的引物对包括核苷酸序列如seq id no.1～2所示的正向引物，以及核苷酸序列如seq idno.3所示的通用反向引物；检测mbi13_11193126分子标记的引物对包括核苷酸序列如seqid no.4～5所示的正向引物，以及核苷酸序列如seq id no.6所示的通用反向引物。

4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内含有权利要求3所述的荧光定量pcr检测引物组合。

5.根据权利要求4所述的鉴定望春玉兰内小白菊内酯含量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内还包含2×castpcr genotyping master mix和ddh2o。

6.权利要求1～2任一项所述的分子标记、权利要求3所述的引物组合和权利要求4～5任一项所述的试剂盒在鉴定望春玉兰内小白菊内酯含量中的应用。

7.一种鉴定望春玉兰内小白菊内酯含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待测望春玉兰的基因组dna；以提取的望春玉兰基因组dna为模板，利用权利要求3中的snp分子标记mbi13_11039065和mbi13_11193126的引物组合对进行荧光定量pcr扩增，若mbi13_11039065扩增产物中为纯合g/g位点，则所述望春玉兰不含有小白菊内酯或者含量低于0.5％；若mbi13_11039065扩增产物中为纯合a/a或者杂合a/g位点，则所述待测望春玉兰小白菊内酯含量高于3.0％；若mbi13_11193126扩增产物中为纯合c/c位点，则所述望春玉兰不含有小白菊内酯或者含量低于0.5％；若mbi13_11039065扩增产物中为纯合t/t或者杂合c/t位点，则所述待测望春玉兰小白菊内酯含量高于3.0％。

8.根据权利要求7所述的鉴定望春玉兰内小白菊内酯含量的方法，其特征在于，所述荧光定量pcr的反应体系包括2×castpcr genotyping master mix、引物组合和ddh2o。

9.根据权利要求7所述的鉴定望春玉兰内小白菊内酯含量的方法，其特征在于，所述荧光定量pcr的扩增程序为94℃预变性15min；94℃变性20s，62℃退火-延伸60s，共10个循环，每个循环结束后退火温度降低0.6℃；94℃变性20s，56℃退火-延伸60s，共30个循环；37℃1min。

10.权利要求1～2任一项所述的分子标记在高含量小白菊内酯的望春玉兰育种中的应用。

技术总结本发明公开了一种望春玉兰内小白菊内酯含量相关的分子标记及其应用。所述分子标记包括Mbi13_11039065和Mbi13_11193126中的至少一种；Mbi13_11039065为13号染色体第11039065位碱基，当该位点的基因分型为纯合G/G时，则该望春玉兰不含有小白菊内酯或者含量低于0.5％，当该位点的基因分型为纯合A/A或者杂合A/G时，则该望春玉兰小白菊内酯含量高于3.0％；Mbi13_11193126为13号染色体第11193126位碱基，当该位点的基因分型为纯合C/C时，则该望春玉兰不含有小白菊内酯或者含量低于0.5％，当该位点的基因分型为纯合T/T或者杂合C/T时，则该望春玉兰小白菊内酯含量高于3.0％。本发明所开发的分子标记Mbi13_11039065和Mbi13_11193126，可以在早期对望春玉兰根皮小白菊内酯含量进行鉴定。技术研发人员：戴晓港,尹佟明,蔡晓凡受保护的技术使用者：南京林业大学技术研发日：技术公布日：2024/6/18