罗汉果醇、赛门苷I和/或罗汉果甜苷Ⅴ的酵母工程菌及其应用的制作方法

本发明涉及微生物工程领域，特别涉及罗汉果醇、赛门苷i和/或罗汉果甜苷ⅴ的酵母工程菌及其应用。

背景技术：

1、罗汉果是一种葫芦科植物，它的果实被用作传统草药，含有多种生物活性成分。

2、罗汉果醇(mogrol)和罗汉果甜苷是罗汉果中应用较多的有效成分。

3、其中，罗汉果醇及其衍生物罗汉果皂苷是一类葫芦烷型三萜糖苷，其中罗汉果皂苷是葫芦烷型三萜糖苷，其苷元为罗汉果醇。罗汉果醇的结构如下式所示：

4、

5、近年来，罗汉果醇的药理作用引起了研究人员的广泛关注，一些研究表明，罗汉果醇能够抑制erk1/2和stat3的信号通路，同时能降低creb的活性，活化ampk。具有抗氧化、抗炎症和降血糖的潜力，对于老年性痴呆以及缺血性脑痴呆引起的空间认知障碍和学习记忆功能下降具有明显的改善作用。在体外细胞实验中发现，mogrol呈剂量依赖性地诱导细胞周期的g0/g1周期停滞，具有有效的抗肿瘤细胞增殖活性。

6、罗汉果甜苷是罗汉果中分离并鉴定出的多种甜苷的统称，基本结构如下：

7、

8、罗汉果甜苷共有相同的罗汉果醇三萜核心，糖苷配基(aglycone)罗汉果醇被不同数目的葡萄糖部分糖基化以形成多种罗汉果苷化合物，葡萄糖基数目及连接方式的不同产生不同的甜苷，罗汉果苷iie、如罗汉果苷v、罗汉果苷iv、赛门苷i等，并且这些罗汉果甜苷在口味上有很大差异，如罗汉果苷iie是未成熟罗汉果的主要皂苷成分，味道极苦，随着罗汉果的生长，其相继转变为罗汉果苷ii1、罗汉果苷iv等，最终成为味道极甜的五糖基化的罗汉果苷v。

9、罗汉果苷ⅴ的甜度是蔗糖的约300-400倍，不仅具有镇咳、祛痰、抗氧化等作用，而且可作为代糖使用，相比于人工糖精更天然健康无副作用，是糖尿病患者和肥胖者食品的良好添加剂。罗汉果苷v的结构如下所示：

10、

11、传统上，罗汉果醇和罗汉果苷是通过水提取罗汉果的果实，然后经过浓缩和分离得到的。一般是将罗汉果果实切碎或粉碎，使用水或其他溶剂浸泡，然后通过过滤和浓缩，分离并通过进一步的纯化步骤，获得高纯度的罗汉果醇或罗汉果苷。这种方法可以保持产物的天然性，但罗汉果醇和罗汉果苷在罗汉果中的含量极少，通常只在1％左右，罗汉果的栽培也存在许多困难，规模化制备的难度大，成本高，难以通过植物提取的方式形成量产，限制了它的广泛应用。也可以以罗汉果苷为原料，通过酸/碱水解制备罗汉果醇，但罗汉果苷的获取也非常不易，成本甚至超过了罗汉果醇，且水解反应的条件较为剧烈，稳定性差，难以获取稳定的终产品。相比之下，采用生物全合成的方式能够降低成本并规模化制备罗汉果醇和罗汉果苷，可控性强，产品稳定。

12、转录组和代谢组学分析是阐明植物天然产物生物合成途经的有效策略。2016年，以色列研究者itkin等根据罗汉果转录组和基因组数据，实现了罗汉果苷ⅴ生物合成途径的完整解析。以葡萄糖为起始底物进行从头合成罗汉果甜苷的代谢途径初始阶段，葡萄糖经过糖酵解由丙酮酸生成乙酰辅酶a，后经mva路径由乙酰辅酶a生成2,3-氧化角鲨烯，并进一步代谢为二糖基化的四羟基葫芦二烯醇，葫芦二烯醇氧化产生罗汉果醇，罗汉果醇支链糖基化产生有甜味的罗汉果苷ⅳ、罗汉果苷ⅴ等。图1为罗汉果甜苷v的生物合成途径示意图，出自《罗汉果甜苷v的合成生物学研究进展》孙泽敏，该示意图基本诠释了罗汉果苷ⅴ生物合成途径。本技术也是基于该合成途径进行的优化、改进。

13、以葡萄糖为起始底物，通过微生物从头合成罗汉果醇或罗汉果苷能够精确的控制合成步骤和条件，从而得到所需的产物，且产物的纯度高，安全绿色环保，是化学合成无法达到的。但是微生物从头合成的代谢通路长，竞争路径网络复杂，对底盘细胞的稳定性和代谢能力要求高，因此需要对底盘细胞进行改造，从而实现产生特定化合物或提高特定代谢产物的产量。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供一种罗汉果醇、赛门苷i和/或罗汉果甜苷ⅴ的酵母工程菌，通过对底盘细胞进行优化改造，改变微生物的代谢通路或调控相关基因表达水平，从而增加目标产物的合成效率和产量，提高生产效率。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了如下任一项或其组合在制备罗汉果醇、赛门苷i和/或罗汉果苷ⅴ中的应用；

4、(i)、过表达mva途径中萜类物质合成的关键限速基因thmg1和idi1(308a)；

5、(ii)、过表达全局转录因子upc2的突变基因upc2-1(416d)；

6、(iii)、过表达乙醛脱氢酶ald6(1622b)、丙酮酸脱羧酶pdc1(1021b)、乙酰辅酶a合成酶acs1(911b)的基因；

7、(iv)、敲除异柠檬酸脱氢酶idh1的基因；

8、(v)、过表达圆红冬孢酵母的柠檬酸裂解酶acl的基因；

9、(vi)、过表达水稻基腐病菌乙醇脱氢酶adh2(208a)的基因。

10、在发明的一些具体实施方案中，如(i)～(vi)任一项或其组合强化mva途径和/或乙酰辅酶a途径。

11、在发明的一些具体实施方案中，直接或间接上调mva途径基因的转录效率；提高乙酰辅酶a的供应量。

12、在发明的一些具体实施方案中，所述如下任一项或其组合还包括：

13、(vii)、整合入sgcds、sgeph3、cyp87d18和/或sgcpr1；

14、(viii)、整合入ugt720-269-1；和/或

15、(ix)、整合入ugt94-289-3。

16、第二方面，本发明提供了基因表达框，其特征在于，包括如下任一项或其组合：

17、(i)、过表达的mva途径中萜类物质合成的关键限速基因thmg1和idi1(308a)；

18、(ii)、过表达的全局转录因子upc2的突变基因upc2-1(416d)；

19、(iii)、过表达的乙醛脱氢酶ald6(1622b)、丙酮酸脱羧酶pdc1(1021b)、乙酰辅酶a合成酶acs1(911b)的基因；

20、(iv)、不包括异柠檬酸脱氢酶idh1的基因；

21、(v)、过表达的圆红冬孢酵母的柠檬酸裂解酶acl的基因；

22、(vi)、过表达的水稻基腐病菌乙醇脱氢酶adh2(208a)的基因。

23、在发明的一些具体实施方案中，所述的基因表达框还包括：

24、(vii)、sgcds、sgeph3、cyp87d18和/或sgcpr1；

25、(viii)、ugt720-269-1；和/或

26、(ix)、ugt94-289-3。

27、第三方面，本发明提供了构建体，包括所述的基因表达框。

28、第四方面，本发明提供了宿主，包括如下任一项：

29、(i)、所述的基因表达框；

30、(ii)、所述的构建体。

31、在发明的一些具体实施方案中，所述的宿主包括但不限于酵母。

32、在发明的一些具体实施方案中，所述的宿主包括酿酒酵母。

33、本发明还提供了构建酵母工程菌的方法，包括如下步骤：

34、过表达mva途径中萜类物质合成的关键限速基因thmg1和idi1(308a)；

35、过表达全局转录因子upc2的突变基因upc2-1(416d)；

36、过表达乙醛脱氢酶ald6(1622b)、丙酮酸脱羧酶pdc1(1021b)、乙酰辅酶a合成酶acs1(911b)；

37、敲除异柠檬酸脱氢酶idh1；

38、过表达圆红冬孢酵母的柠檬酸裂解酶acl；

39、过表达水稻基腐病菌乙醇脱氢酶adh2(208a)。

40、在本发明的一些具体实施方案中，构建酵母工程菌的方法还包括：

41、整合入sgcds、sgeph3、cyp87d18和/或sgcpr1；

42、整合入ugt720-269-1；和/或

43、整合入ugt94-289-3。

44、第五方面，本发明提供了如下任一项或其组合在制备罗汉果醇、赛门苷i和/或罗汉果苷ⅴ中的应用；

45、(i)、所述的基因表达框；

46、(ii)、所述的构建体；

47、(iii)、所述的宿主。

48、第六方面，本发明提供了罗汉果醇、赛门苷i和/或罗汉果苷ⅴ的制备方法：

49、整合所述的基因表达框；或

50、转化所述的构建体；或

51、发酵培养所述的宿主；

52、收集发酵培养液，纯化。

53、本发明提供了一种罗汉果醇、赛门苷i和/或罗汉果甜苷ⅴ的酵母工程菌，通过对底盘细胞进行优化改造，改变微生物的代谢通路或调控相关基因表达水平，从而增加目标产物的合成效率和产量，提高生产效率。