一种生产蜘蛛丝蛋白的家蚕的构建方法及其应用

本发明涉及一种生产蜘蛛丝蛋白的家蚕的构建方法及其应用，属于生物。

背景技术：

1、栽桑养蚕，缫丝织绸，是中华民族对人类物质文明和精神文明的卓越贡献之一。家蚕(bombyx mori)属于昆虫纲鳞翅目蚕蛾科，桑蚕丝也是目前已知的被利用最早、产量最大的天然丝之一。在近现代的世界蚕茧丝绸市场上，我国具有优势主导地位。据统计，在世界丝绸市场上，我国蚕茧约占85％，生丝约占82％。然而随着科学技术的发展，蚕丝纤维被赋予越来越多新的用途。利用丝胶蛋白亲水性，利用家蚕丝胶成功表达了表皮细胞生长因子、胶原蛋白等多种药用性重组蛋白；家蚕丝素则更适合用于表达结构性蛋白，用于提高蚕丝品质及其他结构性蛋白用于蚕丝生物素材的开发，拓宽蚕丝纤维的应用领域。

2、蜘蛛牵引丝是是自然界中综合机械性能最优异的丝纤维之一，强度优异、阻尼性良好并且弹性突出。蜘蛛牵引丝是由序列高度重复的大分子蛋白质(分子量>300kda)masp1、masp2组成的蛋白纤维，强度近似为4gpa，是钢的5倍，有“生物钢”之称，断裂伸长可达50％，是人造纤维kevlar的(的15倍,断裂能可达1*105j/kg，因此蜘蛛丝具有极广阔的应用前景。蜘蛛丝蛋白的规模化制备是蜘蛛丝实用化的关键措施。然而由于蜘蛛的肉食习性、相互残杀等特性，人工大规模饲养蜘蛛来获取蛛丝的努力至今都没能成功。高效的表达系统是大量获得蜘蛛丝蛋白的有效途径之一。

3、2012年，florence teulé等科学家利用转基因技术，构建了表达蜘蛛丝蛋白的转基因家蚕，成功获得了含有蜘蛛丝蛋白的复合丝纤维。自此，利用家蚕丝腺生物反应器异源表达蜘蛛丝成为了获得蜘蛛丝蛋白的新方向。但是，一直以来转基因丝腺生物反应器系统也存在着各种各样的问题：转座子随机整合，这可能会导致转基因家蚕出现基因层次的变化；标记基因保留会增加转基因逃逸的可能性；

4、和很多转基因生物一样，转基因家蚕也存在外源基因表达效率不高的问题，外源蛋白占茧层比例一般不足1％。尤其是在家蚕生物反应器方面，外源基因的整合率和表达水平较低一直困扰着研究人员。

5、在生物体新陈代谢的过程中，由于内部的或外部的原因，经常会发生dna损伤。在进化过程中，生物体演化出dna损伤修复机制，来避免dna损伤引发基因组不稳定。科学家因此建立起基于dna损伤修复的基因组编辑技术。目前，基因编辑技术主要发展了3代：分别是锌脂核酸内切酶、类转录激活因子效应物核酸内切酶和crispr/cas9技术。基因组编辑技术的发展拓宽家蚕丝腺生物反应器的应用和发展。2018年，xujun等人利用talen技术实现了在家蚕中用蜘蛛丝基因替换丝素重链基因进行蜘蛛丝的生产。丝素轻链分子量小，无重复序列，且表达量高。但是，迄今尚未有通过非转基因方式，利用完整的丝素轻链调控序列表达蜘蛛丝基因的报道。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的第一目的是提供了一种生产蜘蛛丝蛋白、且极大程度提高蚕丝延展性的家蚕的构建方法。本发明的第二目的是提供了一种利用家蚕生产蜘蛛丝蛋白的方法。

2、技术方案：本发明的生产蜘蛛丝蛋白的家蚕的构建方法包括以下步骤：

3、(1)在家蚕丝素轻链基因fibl上确定一个talens的靶点，所述靶点位于家蚕丝素轻链基因fibl的第七个外显子上，包括talen左臂fibl-l、talen右臂fibl-r，fibl-l与fibl-r之间有17bp作为切割序列，切割序列距离家蚕丝素轻链基因fibl终止密码子taa直接有34～17bp；

4、(2)分别构建talen-l、talen-r表达质粒，并进行talen-l mrna、talen-r mrna的体外转录；

5、(3)构建donor载体：将masp2基因连接到pgem-l-2a-nrui-ctd-dsred-r载体上构成donor载体；所述masp2基因的核苷酸序列如seq id no:6所示；

6、(4)将talen-l mrna、talen-r mrna和donor载体混合，对家蚕胚胎进行显微注射，进行催青直到孵化，饲养孵化出来的蚁蚕作为g0代，将g0代的蚕蛾自交，获得g1代蚕卵，g1代中眼睛具有红色荧光个体即为可生产蜘蛛丝蛋白的家蚕个体。

7、其中，步骤(1)中所述fibl-l核苷酸序列如seq id no:1所示；fibl-r核苷酸序列如seq id no:2所示；切割序列如seq id no:3所示。

8、其中，步骤(2)中所述表达质粒的构建为将talen-l/talen-r骨架分别与psw-epeas-t载体连接；所述talen-l的氨基酸序列如seq id no:4所示，talen-r的氨基酸序列如seq id no:5所示。

9、其中，步骤(3)中所述pgem-l-2a-nrui-ctd-dsred-r载体的构建方法具体为：以pxl-bacii-3p3-dsred2-sv40为模板，pcr扩增3p3-dsred-sv40筛选标记片段并将其连接在pgem-t easy载体上，构建得到pgem-3p3-dsred-sv40载体；以家蚕多化性品种nistari基因组为模板，分别pcr扩增fibl talens位点上游homo-l和下游homo-r片段，通过引物序列在homo-l 5’端引入talens靶点序列，3’端引入自我剪切肽2a序列；将其连接到pgem-3p3-dsred-sv40载体上，构建得到pgem-l-2a-nrui-dsred-r载体；以家蚕多化性品种nistari基因组为模板，pcr扩增fibl ctd序列，将其连接到pgem-l-2a-nrui-dsred-r载体，构建得到pgem-l-2a-nrui-ctd-dsred-r载体。

10、其中，步骤(3)中所述的自我剪切肽2a的核苷酸序列如seq id no:7所示；fiblctd的核苷酸序列如seq id no:8所示。

11、其中，步骤(3)中所述pcr扩增fibl talens位点上游homo-l片段的引物核苷酸序列如seq id no:12～13所示；扩增fibl talens位点下游homo-r片段的引物核苷酸序列如seq id no:14～15所示。

12、其中，步骤(3)中所述pcr扩增3p3-dsred-sv40筛选标记片段的引物核苷酸序列如seq id no:10～11所示；pcr扩增fibl ctd序列的引物序列如seq id no:16～17所示。

13、本发明还提供了一种利用家蚕生产蜘蛛丝蛋白的方法，所述方法为收集上述方法构建的家蚕的丝腺或蚕茧，提取蜘蛛丝蛋白。

14、其中，当收集的原料为家蚕的丝腺时，加入ripa裂解液，离心提取。

15、其中，当收集的原料为家蚕的蚕茧时，加入尿素溶液，离心提取。

16、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下突出的显著优点：本发明的生产蜘蛛丝蛋白的家蚕的构建方法，基于talen的基因敲入技术实现nephila madagascariensis(圆网马达加斯加络新妇蛛)蜘蛛丝基因major ampullate spidroin 2(masp2)在家蚕丝素轻链基因taa处的融合插入，并通过剪切肽2a将bmfibl与masp2分割，获得一种家蚕非转基因形式的丝素轻链融合表达系统，利用该方法可以大量表达外源蛋白，并将蚕丝的延展性显著提高约95.1％。