一种绿色纤维基因Lg的RNAi干扰方法以及其在改良绿色纤维中的应用

本发明属于分子育种，具体涉及一种绿色纤维基因lg的rnai干扰方法以及其在改良绿色纤维中的应用。

背景技术：

1、天然彩色棉是指不加任何后期的人为修饰，在其纤维的自身生长发育过程中便会累积色素，从而呈现天然色彩的一类棉纤维材料。与常规白色棉相比，天然彩色棉纤维在加工成彩色的织物过程中不需要印染、漂洗等工序，化学污染少，能源消耗低，是环境友好型的绿色生态纺织材料。现今社会对彩色织物的需求量巨大，人们的健康和环保意识也日益增强，因此，天然彩色棉具有非常大的市场应用前景。

2、绿色棉是现存天然彩色棉的一种。绿色棉中存在绿色纤维基因lg，其促使纤维呈色，并且，lg编码一个r2r3-myb转录因子，在绿色纤维的次生壁时期特异高水平表达，能显著激活木栓质途径的相关基因，并促进木栓质在纤维中沉积，而木栓质是绿色纤维的主要呈色色素。lg在绿色棉纤维中的表达从开花后15天开始，到纤维次生壁发育的后期(开花后35天)仍具有很高的表达水平，由于lg的表达刚好贯穿绿色棉纤维次生壁发育的整个时期，促进了木栓质在次生壁时期大量积累，但是木栓质在纤维中的积累会影响纤维素在纤维中的沉积，导致绿色纤维的产量和品质下降，这也是目前绿色棉纤维得不到改良的一个重要原因。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种绿色纤维基因lg的rnai干扰方法以及其在改良绿色纤维中的应用。本发明通过扩展蛋白(expansin)expa2基因启动子pexpa2表达lg的rnai片段，在绿色纤维次生壁发育初期降低lg的表达水平，以实现在不改变绿色纤维着色的情况下对绿色纤维的产量品质进行改良。

2、本发明提供了一种能在棉花纤维伸长期和次生壁发育初期高表达目的基因的启动子pexpa2，所述启动子pexpa2的核苷酸序列如seq id no.1所示。

3、本发明还提供了上述方案所述的启动子pexpa2在提高棉花中目的基因表达量中的应用；优选的，所述目的基因的表达部位为开花后5～20天的棉纤维；进一步优选的，所述目的基因表达的部位为开花后15～20天的棉纤维。

4、本发明还提供了一种能在棉花的纤维次生壁发育的初期降低lg表达水平的表达盒，包括上述方案所述启动子pexpa2和用于干扰lg的rnai片段；优选的，所述用于干扰lg的rnai片段的核苷酸序列如seq id no.4所示。

5、本发明还提供了一种能在棉花的纤维次生壁发育的初期降低lg表达水平的干扰载体，包括上述方案所述启动子pexpa2和用于干扰lg的rnai片段；优选的，所述用于干扰lg的rnai片段的核苷酸序列如seq id no.4所示；优选的，所述干扰载体的骨架载体包括plgn-35s；所述启动子pexpa2插入在plgn-35s的hindⅲ和bamhⅰ酶切位点之间，替换plgn-35s上原有的35s启动子。

6、本发明还提供了上述方案所述的干扰载体的构建方法，包括以下步骤：

7、以陆地棉‘冀棉14’的基因组dna为模板，利用引物pexpa2-f和pexpa2-r进行pcr扩增，得到带有同源臂的pexpa2片段；

8、采用hindⅲ和bamhⅰ对plgn-35s载体双酶切，去除plgn-35s载体上原有的35s启动子，得到第一线性化质粒；

9、将所述第一线性化质粒与所述带有同源臂的pexpa2片段进行同源重组，得到含pexpa2的plgn重组载体；

10、采用bamhⅰ和ecorⅰ对所述含pexpa2的plgn重组载体进行双酶切，得到第二线性化质粒；

11、以陆地棉‘t586’的基因组dna为模板，利用引物elgi-f1和elgi-r1进行pcr扩增，得到lg-rnai元件的互补链；所述elgi-f1的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述elgi-r1的核苷酸序列如seq id no.6所示；

12、以陆地棉‘t586’的基因组dna为模板，利用引物elgi-f2和elgi-r2进行pcr扩增，得到lg-rnai元件的内含子-正链；所述elgi-f2的核苷酸序列如seq id no.7所示；所述elgi-r2的核苷酸序列如seq id no.8所示；

13、将所述第二线性化质粒、lg-rnai元件的互补链和lg-rnai元件的内含子-正链混合，进行重组反应，得到干扰载体。

14、本发明还提供了一种宿主菌，包括上述方案所述的干扰载体或者所述构建方法得到的干扰载体。

15、本发明还提供了一种绿色纤维基因lg的rnai干扰方法，包括以下步骤：将上述方案所述宿主菌导入棉花受体。

16、本发明还提供了上述方案所述的启动子pexpa2、所述的表达盒、所述的干扰载体、所述构建方法得到的干扰载体、所述的宿主菌或者所述的rnai干扰方法在构建转基因棉花、改良绿色棉纤维和/或提高绿色棉纤维产量中的应用。

17、本发明还提供了一种创制转基因杂交绿色棉的方法，包括以下步骤：

18、将上述方案所述宿主菌导入棉花受体，对所述棉花受体进行培养，得到转基因棉花；

19、以所述转基因棉花为父本，以绿色棉为母本，进行杂交，得到f1代；

20、对所述f1代进行播种，得到f1代植株，保留所述f1代植株中成熟纤维为绿色的植株，收取种子，得到f2代；

21、对所述f2代进行播种，得到f2代植株，通过分子生物学手段鉴定所述f2代植株中是否含有干扰载体。

22、优选的，对所述棉花受体进行培养后，还包括鉴定培养得到的棉花植株中是否成功导入含有干扰载体的宿主菌；所述鉴定培养得到的棉花植株中是否成功导入含有干扰载体的宿主菌优选的包括以下步骤：提取待测植株的基因组dna，以所述基因组dna为模版，采用引物elgi-f3和pexpa2-r1进行pcr扩增，若扩增得到666bp片段，则判定干扰载体成功转入到了受体棉花中；所述elgi-f3的核苷酸序列如seq id no.9所示；所述pexpa2-r1的核苷酸序列如seq id no.10所示；

23、在鉴定到培养得到的棉花植株中成功导入含有干扰载体的宿主菌后，本发明优选的还包括鉴定干扰载体在棉花植株中是否有功能；所述鉴定干扰载体在棉花植株中是否有功能优选的包括以下步骤：采用引物rt-lgi-f和rt-lgi-r对开花后15天的转基因棉纤维cdna进行定量pcr检测，当待测阳性植株中lg的表达量低于野生型植株‘豫早1号’时，则判定干扰载体在棉花植株中有功能；所述rt-lgi-f的核苷酸序列如seq id no.11所示所述rt-lgi-f核苷酸序列如seq id no.12所示；所述定量pcr检测的内参基因优选为ghactin4，用于扩增所述内参基因的引物优选为ghact4-f和ghact4-r；所述ghact4-f的核苷酸序列如seq id no.13所示；所述ghact4-r的核苷酸序列如seq id no.14所示；

24、得到f2代后，优选的还包括通过分子生物学手段鉴定所述f2代植株中是否含有干扰载体；所述通过分子生物学手段鉴定所述f2代植株中是否含有干扰载体优选的包括以下步骤：提取f2代植株的基因组dna，以所述f2代植株的基因组dna为模板，采用引物elgi-f3和引物pexpa2-r1进行pcr扩增，若扩增得到666bp的片段，则为判定f2代植株中含有干扰载体；

25、在鉴定f2代植株中含有干扰载体后，优选的还包括鉴定f2代植株是否是母本的后代；当所述母本为转基因绿色棉‘flgt’时，鉴定f2代植株是否是母本的后代优选的包括以下步骤：提取所述f2代植株的基因组dna，以所述f2代植株的基因组dna为模板，采用引物flgt-f和flgt-r进行pcr扩增，若扩增得到497bp的片段，则判定f2代植株是母本的后代；所述flgt-f的核苷酸序列如seq id no.15所示；所述flgt-r的核苷酸序列如seq id no.16所示；

26、在鉴定f2代植株中含有干扰载体且是母本的后代后，本发明优选的还包括鉴定f2代植株中的干扰载体是否发挥了作用；所述鉴定f2代植株中的干扰载体是否发挥了作用优选的包括以下步骤：采用引物rt-lgi-f1和rt-lgi-r1对开花后15天的f2代植株的棉纤维cdna进行定量pcr检测，若lg在开花后15天的纤维中表达下降，说明干扰载体发挥了作用；所述rt-lgi-f1的核苷酸序列如seq id no.17所示；所述rt-lgi-r1的核苷酸序列如seq idno.18所示。

27、本发明提供了一种能在棉花的纤维伸长期和次生壁发育的初期(约开花后5～20天)高表达目的基因的启动子pexpa2。由于lg的表达刚好贯穿绿色棉纤维次生壁发育的整个时期，促进了木栓质在次生壁时期大量积累，导致绿色纤维的产量和品质下降。基于此，可以通过在纤维次生壁初期降低lg的表达，延缓木栓质(色素)在纤维次生壁中的沉积，从而降低木栓质和纤维素之间竞争对纤维次生壁发育的影响，使纤维素更多的在纤维中积累，从而实现在较小影响绿色纤维着色的情况下对绿色纤维改良(原理图参见图1)。本发明在纤维次生壁发育的前期降低lg的表达水平不仅可以降低操纵lg后对纤维着色的影响，还能积累更多的纤维素。因此，本发明的启动子pexpa2能够通过在绿色棉纤维中改变原有的lg表达模式，降低木栓质和纤维素之间竞争对纤维次生壁发育的影响，并以此获得改良的绿色棉纤维。

28、本发明提供了一种能在棉花的纤维次生壁发育的初期降低lg表达水平的干扰载体，包括启动子pexpa2和用于干扰lg的rnai片段(lg-rnai元件)。本发明还提供了一种绿色纤维基因lg的rnai干扰方法，包括以下步骤：将含有所述干扰载体的宿主菌导入棉花受体。lg本来在开花后15天(15dpa)左右的纤维中开始表达，但这样得到的绿色纤维很差基本不能进行应用。本发明通过expa2基因启动子pexpa2来干扰lg的表达，使lg在15～20dpa纤维中的表达量降低，这样lg只能在20dpa后才能较高水平的表达，那么在15～20dpa由于lg表达水平很低，纤维中合成的木栓质就很少，由于没有木栓质的沉积，纤维素就能在次生壁发育早期(25dpa前，因为lg从20dpa开始高水平表达，到纤维中积累大量的木栓质还需要一段反应时间)以高速率进行积累，纤维中沉积更多的纤维素，绿色纤维因此就获得改良。由于lg从15dpa开始往后表达，expa2的表达从5dpa～20dpa，所以lg和expa2的表达再开花后15天到20天的纤维中都表达(lg在15天前的纤维中不表达，expa2在20天后的纤维中不表达或者说表达水平很低)，所以才能用expa2基因启动子表达lg-rnai元件，在15～20dpa(次生壁发育初期)的纤维中降低lg的表达。