一种产玉米黄质的酿酒酵母菌株的构建方法

本发明涉及生物，特别涉及一种产玉米黄质的酿酒酵母菌株的构建方法。

背景技术：

1、玉米黄质是自然界中常见的一种橘红色脂溶性萜烯化合物，属于类胡萝卜素。它广泛存在于水果和蔬菜中，以及一些细菌和微藻中。玉米黄质的主要食物来源是玉米和玉米产品。玉米黄质通常存在于人类和动物的皮肤和眼睛中，对皮肤和眼睛有保护作用。此外，玉米黄质具有抗氧化，抗炎，抗癌，和神经保护特性。对类胡萝卜素市场的研究表明，未来五年市场估值将进一步增加。目前玉米黄质的主要来源为植物提取、化学合成和微生物合成。由于植物提取高昂的生产方法而造成较低的收益率，而化学合成的玉米黄质虽然可以用于商业化生产，但由于其较低的品质只能作为颜料而不能用作食品添加剂或药物，因此微生物合成以其低成本、高产量、产品安全性和绿色环保的优越性被视为最有前途的生产方法。微生物发酵过程中只需控制温度、溶解氧等少数参数，原料生产不受气候、地域限制。xie等人改变光强度以增加海洋红藻中的玉米黄质浓度，vila等人改变氧气供应以增加玉米黄质浓度，breitenbach等人通过不同的基因整合方法在红发夫酵母中实现了5.2mg/gdcw的玉米黄质产量。shen等人将酿酒酵母的动态可控甲羟戊酸(mva)途径整合到大肠杆菌中，通过补料分批发酵将玉米黄质浓度提高到722.46mg/l。liu等人通过化学诱变和基因过表达将鞘氨醇菌中的玉米黄质浓度提高到479.5mg/l。目前还没有能产生高效价玉米黄质的酿酒酵母菌株，这限制了工程菌对玉米黄质的工业化生产。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种产玉米黄质的酿酒酵母菌株的构建方法，通过引入氧化还原酶以及调节内源辅因子平衡，提供一株高产玉米黄质的重组酿酒酵母菌株。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了如下任意项在提高特定生物体玉米黄质产量中的应用：

4、(i)、rfnr1和fd3；

5、(ii)、rfnr1、fd3、rib1和flx1；

6、(iii)、rfnr1的编码基因和fd3的编码基因；

7、(iv)、rfnr1的编码基因、fd3的编码基因、rib1的编码基因和flx1的编码基因；

8、所述特定生物体为藻、真菌和/或细菌；

9、所述真菌包括酵母；

10、所述酵母包括酿酒酵母、解脂属(yarrowia)酵母或克鲁维属(kluyveromyces)酵母中的一种或多种；

11、所述细菌包括链霉菌、大肠杆菌或枯草芽孢杆菌中的一种或多种。

12、在本发明的一些具体实施方案中，上述应用中所述特定生物体的基因型为δgal1/7/10::nat-terg13-erg13-pgal7-terg19-erg19-pgal1/10-erg10-terg10；δypl062w::dr-tcyc1-btcrti-pgal1/10-pacrtb-tpgk1；trp1::trp1_tcyc1-btcrti-pgal1/10-pacrtb-tpgk1；leu2::leu2_ttdh2-dr-tcyc1-btcrti-pgal3-tact1-thmg1-pgal1/10-tmcrte-tgpm1；his3::his3-teno2-tact1-thmg1-pgal1/10-(bts1-erg20)-tfba1；δyglctau3::hpha-tidi1-idi1-pgal7-tpdc1-sapmk-pgal1/10-samk-thxt7；δymrwdelta15::uas-pgal1-pacrty-tadh1-dr；δynrcdelta9::uas-pgal1-pacrty-tadh1-dr；δho::pgal1-eucrtz-this5t-dr；δlpp1,δdpp1::dr；δty4::pgal1-eucrtz-this5-dr；δypl062w::pgal1-eucrtz-this5-dr。

13、在本发明的一些具体实施方案中，上述应用中所述特定生物体为酿酒酵母sybe_sc0123z021。

14、在本发明的一些具体实施方案中，上述应用的所述rfnr1来源于arabidopsisthaliana；和/或

15、所述fd3来源于arabidopsis thaliana。

16、本发明还提供了表达盒组合，包括atrfnr1表达盒、atfd3表达盒、rib1表达盒和flx1表达盒；

17、所述atrfnr1表达盒为来源于arabidopsis thaliana的rfnr1的表达盒；

18、所述atfd3表达盒为来源于arabidopsis thaliana的fd3的表达盒。

19、在本发明的一些具体实施方案中，上述表达盒组合所述atrfnr1表达盒包括ptef1-atrfnr1-tgpm1。

20、在本发明的一些具体实施方案中，上述表达盒组合所述atfd3表达盒包括ptdh3-atfd3-tpgi1。

21、在本发明的一些具体实施方案中，上述表达盒组合所述rib1表达盒包括tpgi1-rib1-pgal1/10。

22、在本发明的一些具体实施方案中，上述表达盒组合所述flx1表达盒包括pgal1/10-flx1-ttef2。

23、本发明还提供了表达模块，包括表达模块1和表达模块2；

24、所述表达模块1具有atrfnr1表达盒和atfd3表达盒；

25、所述表达模块2具有rib1表达盒和flx1表达盒；

26、所述atrfnr1表达盒为来源于arabidopsis thaliana的rfnr1的表达盒；

27、所述atfd3表达盒为来源于arabidopsis thaliana的fd3的表达盒。

28、在本发明的一些具体实施方案中，上述表达模块所述atrfnr1表达盒包括ptef1-atrfnr1-tgpm1。

29、在本发明的一些具体实施方案中，上述表达模块所述atfd3表达盒包括ptdh3-atfd3-tpgi1。

30、在本发明的一些具体实施方案中，上述表达模块所述rib1表达盒包括tpgi1-rib1-pgal1/10。

31、在本发明的一些具体实施方案中，上述表达模块所述flx1表达盒包括pgal1/10-flx1-ttef2。

32、在本发明的一些具体实施方案中，上述表达模块的所述表达模块1包括ptef1-atrfnr1-tgpm1-ptdh3-atfd3-tpgi1；或

33、ptef1-atrfnr1-tgpm1-ptdh3-atfd3-tpgi1-g418r。

34、在本发明的一些具体实施方案中，上述表达模块的所述表达模块2包括tpgi1-rib1-pgal1/10-flx1-ttef2。

35、本发明还提供了表达载体，包括表达载体1和表达载体2；

36、所述表达载体1具有atrfnr1表达盒和atfd3表达盒；

37、所述表达载体2具有rib1表达盒和flx1表达盒；

38、所述atrfnr1表达盒为来源于arabidopsis thaliana的rfnr1的表达盒；

39、所述atfd3表达盒为来源于arabidopsis thaliana的fd3的表达盒。

40、在本发明的一些具体实施方案中，上述表达载体所述atrfnr1表达盒包括ptef1-atrfnr1-tgpm1。

41、在本发明的一些具体实施方案中，上述表达载体所述atfd3表达盒包括ptdh3-atfd3-tpgi1。

42、在本发明的一些具体实施方案中，上述表达载体所述rib1表达盒包括tpgi1-rib1-pgal1/10。

43、在本发明的一些具体实施方案中，上述表达载体所述flx1表达盒包括pgal1/10-flx1-ttef2。

44、在本发明的一些具体实施方案中，上述表达载体的所述表达载体1具有ptef1-atrfnr1-tgpm1-ptdh3-atfd3-tpgi1；或

45、ptef1-atrfnr1-tgpm1-ptdh3-atfd3-tpgi1-g418r。

46、在本发明的一些具体实施方案中，上述表达载体的所述表达载体2具有tpgi1-rib1-pgal1/10-flx1-ttef2。

47、在本发明的一些具体实施方案中，上述表达载体的所述表达载体1具有ptef1-atrfnr1-tgpm1-ptdh3-atfd3-tpgi1；或

48、ptef1-atrfnr1-tgpm1-ptdh3-atfd3-tpgi1-g418r；或

49、ydl226c-l-ptef1-atrfnr1-tgpm1-ptdh3-atfd3-tpgi1-g418-ydl226c-r。

50、在本发明的一些具体实施方案中，上述表达载体的所述表达载体2包括prs416k-tpgi1-rib1-pgal1/10-flx1-ttef2。

51、本发明还提供了生物体，包括藻、真菌和/或细菌，具有atrfnr1表达盒和atfd3表达盒；

52、所述atrfnr1表达盒为来源于arabidopsis thaliana的rfnr1的表达盒；

53、所述atfd3表达盒为来源于arabidopsis thaliana的fd3的表达盒。

54、在本发明的一些具体实施方案中，上述生物体的基因型为δgal1/7/10::nat-terg13-erg13-pgal7-terg19-erg19-pgal1/10-erg10-terg10；δypl062w::dr-tcyc1-btcrti-pgal1/10-pacrtb-tpgk1；trp1::trp1_tcyc1-btcrti-pgal1/10-pacrtb-tpgk1；leu2::leu2_ttdh2-dr-tcyc1-btcrti-pgal3-tact1-thmg1-pgal1/10-tmcrte-tgpm1；his3::his3-teno2-tact1-thmg1-pgal1/10-(bts1-erg20)-tfba1；δyglctau3::hpha-tidi1-idi1-pgal7-tpdc1-sapmk-pgal1/10-samk-thxt7；δymrwdelta15::uas-pgal1-pacrty-tadh1-dr；δynrcdelta9::uas-pgal1-pacrty-tadh1-dr；δho::pgal1-eucrtz-this5t-dr；δlpp1,δdpp1::dr；δty4::pgal1-eucrtz-this5-dr；δypl062w::pgal1-eucrtz-this5-dr。

55、在本发明的一些具体实施方案中，上述生物体为重组酿酒酵母sybe_sc0123z021。

56、在本发明的一些具体实施方案中，上述生物体为重组酿酒酵母，其构建方法为：将atrfnr1表达盒和atfd3表达盒整合至sybe_sc0123z021的ydl226c位点；

57、所述atrfnr1表达盒为来源于arabidopsis thaliana的rfnr1的表达盒；

58、所述atfd3表达盒为来源于arabidopsis thaliana的fd3的表达盒。

59、在本发明的一些具体实施方案中，上述生物体具有上述表达盒组合、上述表达模块或上述表达载体。

60、在本发明的一些具体实施方案中，上述生物体为重组酿酒酵母，其构建方法为：将具有rib1表达盒和flx1表达盒的重组载体导入上述生物体。

61、本发明还提供了构建玉米黄质产量更高的生物体的方法，包括：

62、(i)、将来源于arabidopsis thaliana的rfnr1的表达盒和来源于arabidopsisthaliana的fd3的表达盒整合至可合成玉米黄质的重组生物体的基因组，获得玉米黄质产量更高的生物体；或

63、(ii)、将来源于arabidopsis thaliana的rfnr1的表达盒和来源于arabidopsisthaliana的fd3的表达盒整合至可合成玉米黄质的重组生物体的基因组，并过表达所述重组生物体的rib1和flx1，获得玉米黄质产量更高的生物体。

64、在本发明的一些具体实施方案中，上述方法的所述重组生物体的基因型为δgal1/7/10::nat-terg13-erg13-pgal7-terg19-erg19-pgal1/10-erg10-terg10；δypl062w::dr-tcyc1-btcrti-pgal1/10-pacrtb-tpgk1；trp1::trp1_tcyc1-btcrti-pgal1/10-pacrtb-tpgk1；leu2::leu2_ttdh2-dr-tcyc1-btcrti-pgal3-tact1-thmg1-pgal1/10-tmcrte-tgpm1；his3::his3-teno2-tact1-thmg1-pgal1/10-(bts1-erg20)-tfba1；δyglctau3::hpha-tidi1-idi1-pgal7-tpdc1-sapmk-pgal1/10-samk-thxt7；δymrwdelta15::uas-pgal1-pacrty-tadh1-dr；δynrcdelta9::uas-pgal1-pacrty-tadh1-dr；δho::pgal1-eucrtz-this5t-dr；δlpp1,δdpp1::dr；δty4::pgal1-eucrtz-this5-dr；δypl062w::pgal1-eucrtz-this5-dr。

65、在本发明的一些具体实施方案中，上述方法的所述生物体为重组酿酒酵母sybe_sc0123z021。

66、在本发明的一些具体实施方案中，上述方法包括如下步骤：

67、s1：将来源于arabidopsis thaliana的rfnr1的表达盒和来源于arabidopsisthaliana的fd3的表达盒整合至sybe_sc0123z021的ydl226c位点；

68、s2：将具有rib1表达盒和flx1表达盒的重组载体导入所述sybe_sc0123z021，获得玉米黄质产量更高的生物体。

69、在本发明的一些具体实施方案中，上述生物体、上述方法中的所述atrfnr1表达盒为ptef1-atrfnr1-tgpm1。

70、在本发明的一些具体实施方案中，上述生物体、上述方法中的所述atfd3表达盒为ptdh3-atfd3-tpgi1。

71、在本发明的一些具体实施方案中，上述生物体、上述方法中的所述rib1表达盒包括tpgi1-rib1-pgal1/10。

72、在本发明的一些具体实施方案中，上述生物体、上述方法中的所述flx1表达盒包括pgal1/10-flx1-ttef2。

73、本发明的酿酒酵母菌株及其构建方法有如下效果：

74、本发明确定了加强电子传输对玉米黄质异源合成的必要性，以及玉米黄质的异源合成路径对内源代谢产生了辅因子不平衡扰乱，为后续继续优化提产玉米黄质提供了有力证据，最终获得了高产玉米黄质的酿酒酵母菌株。