一种鉴定猫等孢球虫和芮氏等孢球虫的双重PCR检测引物组、检测方法及其应用

本发明属于生物，具体地，涉及一种鉴定猫等孢球虫和芮氏等孢球虫的双重pcr检测引物组、检测方法及其应用。

背景技术：

1、猫球虫病是由球虫寄生于猫小肠和大肠黏膜上皮细胞内引起的一种原虫病，可导致出血性肠炎、脱水、贫血、厌食、体重减轻和呕吐。猫球虫属于顶复器门、孢子虫纲、球虫亚纲、真球虫目、艾美耳科、等孢球虫属，有猫等孢球虫和芮氏等孢球虫两种。猫发生球虫感染时，如果只从腹泻、血便、发热、脱水、厌食、消瘦等临床症状判断，极度容易被误诊为猫胃肠炎、猫瘟等，影响疾病的诊断与治疗。为了更准确地鉴别诊断猫球虫病，需要进行病原学诊断。猫等孢球虫卵囊呈蛋形或宽卵圆形，其寄生于小肠，主要在回肠的绒毛表面上皮细胞内。芮氏等孢球虫卵囊呈卵圆形或椭圆形，其寄生于整个小肠，在绒毛上皮细胞和李氏腺中均可见。猫等孢球虫的潜隐期比芮氏等孢球虫的长，其传染性比芮氏等孢球虫强，而其致病性比芮氏等孢球虫弱。由此可见，猫等孢球虫和芮氏等孢球虫在生物学特性和致病性有一定的差异，流行率可能也不同，因此，完成对这两种球虫的鉴别诊断是防控该疾病的一大关键。

2、目前应用于猫球虫检测的传统检测方法有直接涂片法、漂浮法和染色法等，其存在容易漏检、需要掌握一定寄生虫知识的人员、主观性较强以及感染强度较低时容易出现假阴性等问题。而应用于猫球虫的pcr检测方法包括常规pcr方法、巢式pcr方法和qpcr方法3种。常规pcr方法和巢式pcr方法不能鉴定出猫球虫的种类，需建立双重pcr方法，但常规双重pcr方法和双重巢式pcr方法操作繁琐，耗时长。使用taqman探针法qpcr可以对猫球虫的种类进行鉴定，但探针设计难度大且合成费用较贵，实验成本较高。而荧光染料法qpcr法虽然可以通过熔解曲线分析产物的特异性，但其所使用的染料为非饱和荧光染料，无法通过熔解曲线分析鉴定出卵囊种类，不适合多重qpcr检测。高分辨率溶解曲线(hrm)是一种建立在实时荧光定量pcr基础上的新技术，在pcr扩增完成后，通过高分辨率仪器检测扩增产物中饱和荧光染料的荧光强度变化，获得特征性熔解曲线，根据其位置和形状的变化来判断序列的突变与否。hrm方法具有特异性高、敏感性强、闭管操作、快速、廉价和污染小等优点，被广泛应用于寄生虫检测和分型中，但目前并没有建立hrm方法对猫等孢球虫和芮氏等孢球虫进行鉴别诊断的相关报道。综上所述，目前猫球虫检测手段较少，显微镜检测和pcr检测技术较为局限，这将不利于猫球虫病的防控，因此，需要建立一种操作简便灵活、敏感性高、特异性强以及成本低的检测方法来鉴定猫等孢球虫和芮氏等孢球虫。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种鉴定猫等孢球虫和芮氏等孢球虫的双重pcr检测引物组。

2、本发明的第二个目的在于提供一种鉴定猫等孢球虫和芮氏等孢球虫的双重pcr检测方法。

3、本发明的第三个目的在于提供所述鉴定猫等孢球虫和芮氏等孢球虫的双重pcr检测引物组及检测方法的应用。

4、本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

5、本发明基于猫等孢球虫和芮氏等孢球虫的its-1序列设计特异性扩增引物，并根据引物是否能扩增出两种猫球虫、引物的敏感性和特异性以及是否能准确鉴别两种等孢球虫，筛选得到最优组ifits-f6/r6(猫等孢球虫)和irits-f6/r6(芮氏等孢球虫)，所得ifits-f6/r6和irits-f6/r6对猫等孢球虫和芮氏等孢球虫均有较高的敏感性，能够准确鉴别两种等孢球虫。

6、因此，本发明首先提供一种用于鉴定猫等孢球虫和芮氏等孢球虫的双重pcr检测引物组，包括ifits-f6/r6和irits-f6/r6引物对；

7、所述ifits-f6/r6引物对，包括上游引物ifits-f6，其核苷酸序列如seq no.1所示：gggctggagcataatggatg；下游引物ifits-r6，其核苷酸序列如seqno.2所示：gcagaaatggaagtagacagct；

8、所述irits-f6/r6引物对，包括上游引物irits-f6，其核苷酸序列如seqno.3所示：gccgctttaagagcattagtcg；下游引物irits-r6，其核苷酸序列如seq no.4所示：ggggaccaaaacaggcag。

9、进一步地，所述ifits-f6/r6引物对和irits-f6/r6引物对的摩尔浓度比为(5～6)：(3～6)。

10、进一步地，所述ifits-f6/r6引物对和irits-f6/r6引物对的摩尔浓度比为6：(3～6)。

11、进一步地，所述ifits-f6/r6引物对和irits-f6/r6引物对的摩尔浓度比为2:1。

12、优选地，ifits-f6/r6和irits-f6/r6引物对的引物浓度分别为0.6μmol/l和0.3μmol/l。

13、本发明提供任一所述双重pcr检测引物组合物在制备鉴定猫等孢球虫和芮氏等孢球虫的检测试剂盒中的应用。

14、本发明提供一种用于鉴定猫等孢球虫和芮氏等孢球虫的检测试剂盒，含有上述任一所述双重pcr检测引物组。

15、进一步地，所述检测试剂盒还含有双重pcr-hrm反应所需试剂。

16、优选地，所述双重pcr-hrm反应所需试剂包括但不限于2×hrm analysis premix、ddh2o等。

17、本发明提供任一所述双重pcr检测引物组在开发不以疾病诊断或治疗为目的的鉴定猫等孢球虫和芮氏等孢球虫的pcr检测方法中的应用。

18、本发明提供一种用于非疾病诊断或治疗目的的鉴定猫等孢球虫和芮氏等孢球虫的双重pcr-hrm检测方法，包括以下步骤：

19、s1.提取检测样品dna；

20、s2.以步骤s1得到的样品dna为模板，采用上述任一所述双重pcr检测引物组进行双重pcr-hrm反应；

21、s3.根据步骤s2双重pcr-hrm反应的溶解曲线进行判别，若熔解曲线峰值大于12且熔解温度tm值在81.15℃～81.94℃，则可判定为猫等孢球虫阳性；若熔解曲线峰值大于19且熔解温度tm值在84.41℃～85.31℃，则可判定为芮氏等孢球虫阳性。

22、本发明基于上述用于鉴定猫等孢球虫和芮氏等孢球虫的双重pcr检测引物组开发了一种用于鉴定猫等孢球虫和芮氏等孢球虫的双重pcr-hrm检测方法，并对引物浓度和退火温度的进行优化；建立的双重pcr-hrm检测方法具有良好的特异性及敏感性，双重pcr-hrm反应仅扩增猫等孢球虫和芮氏等孢球虫，对大肠杆菌、沙门氏菌、刚地弓形虫、隐孢子虫、狮弓蛔虫、猫弓首蛔虫、锡兰钩口钩虫、曼氏迭宫绦虫和猫瘟病毒等均不能扩增；猫等孢球虫可检测出的最低浓度为1.04×101copies/μl，芮氏等孢球虫可检测出的最低浓度为1.17×10-1copies/μl。建立的方法批内与批间重复阈值的变异系数均小于2％，重复效果良好；标准曲线的构建结果显示猫等孢球虫和芮氏等孢球虫的标准曲线方程分别为y＝-3.388x+39.04和y＝-3.191x+37.51，相关系数r2分别为0.996和0.999，具有良好的线性关系，且能很好地鉴别出是否存在混合感染。进一步将所述方法应用于临床样品检测，结果显示，双重pcr-hrm方法的球虫检出率显著高于显微镜检测方法(p<0.05)，且与巢式pcr检测相比，能快速有效地区分猫等孢球虫与芮氏等孢球虫。

23、进一步地，步骤s2所述双重pcr检测引物组中ifits-f6/r6引物对和irits-f6/r6引物对的摩尔浓度比为(5～6)：(3～6)。

24、优选地，步骤s2所述双重pcr检测引物组中ifits-f6/r6引物对和irits-f6/r6引物对的摩尔浓度比为6：(3～6)。

25、优选地，步骤s2所述双重pcr检测引物组中ifits-f6/r6引物对和irits-f6/r6引物对的摩尔浓度比为2：1。

26、进一步地，步骤s2所述双重pcr-hrm反应体系含有以下体积份数的各组分：20份2×hrm analysis premix、2.4份ifits-f6、2.4份ifits-r6、1.2份irits-f6、1.2份irits-r6、11.8份样品dna、11.8份ddh2o；其中引物ifits-f6/r6、irits-f6/r6浓度为10μm。

27、优选地，步骤s2所述双重pcr-hrm反应体系为2×hrm analysis premix20μl，10μmifits-f6 2.4μl，10μm ifits-r6 2.4μl，10μm irits-f6 1.2μl，10μm irits-r6 1.2μl，dna模板1μl，ddh2o 11.8μl，总体积40μl。

28、进一步地，步骤s2所述双重pcr-hrm反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性10sec、56～58℃退火20sec、72℃延伸24sec，30个循环；熔解条件为95℃预变性1min；40℃退火1min，荧光信号采集从78℃到89℃，连续采集荧光15次/℃。

29、优选地，步骤s2所述双重pcr-hrm反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性10sec、57℃退火20sec、72℃延伸24sec，30个循环；熔解条件为95℃预变性1min；40℃退火1min，荧光信号采集从78℃到89℃，连续采集荧光15次/℃。

30、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

31、本发明提供一种鉴定猫等孢球虫和芮氏等孢球虫的双重pcr检测引物组及其检测方法。通过筛选得到一种猫等孢球虫和芮氏等孢球虫的双重pcr检测引物组，包括ifits-f6/r6引物对和irits-f6/r6引物对。基于所述双重pcr检测引物组合物建立了双重pcr-hrm方法，所述方法仅扩增猫等孢球虫和芮氏等孢球虫，对大肠杆菌、沙门氏菌、刚地弓形虫、隐孢子虫、狮弓蛔虫、猫弓首蛔虫、锡兰钩口钩虫、曼氏迭宫绦虫和猫瘟病毒等均不能扩增，具有良好的特异性；对猫等孢球虫和芮氏等孢球虫的检测最低限分别为1.04×101copies/μl和1.17×10-1copies/μl，且批内和批间重复性试验的变异系数都小于2％，表明方法敏感性高，稳定、重现性好；本发明建立的双重pcr-hrm方法对球虫检出率和合并感染的检出率显著高于显微镜检测(p<0.05)，其球虫检出率高于巢式pcr检测，且能快速有效地区分猫等孢球虫与芮氏等孢球虫。