一种可靶向递送ATRA的FAP可活化脂质体及其制备方法与应用

本发明涉及生物医药，具体涉及一种可靶向递送atra的fap可活化脂质体及其制备方法与应用。

背景技术：

1、胰腺癌病人5年期生存率不足10％。大部分病人确诊时已处于晚期，不宜手术，因此，化疗仍是主要的治疗手段。临床上用于胰腺癌的化疗药物主要包括：吉西他滨联合白蛋白结合型紫杉醇；氟尿嘧啶、叶酸、伊立替康、奥沙利铂四联疗法。然而，这些药物疗效有限：白蛋白紫杉醇联合吉西他滨使病人生存期由6.7月延长至8.5月，延长仅1.8月；氟尿嘧啶四联疗法可使病人生存期由6.8月延长至11.1月，延长4.3月，但同时引起了严重毒副反应。

2、胰腺癌微环境由基质细胞(如胰腺星型细胞(pancreatic stellate cells，pscs)、内皮细胞、免疫细胞)和细胞外基质(extracellular matrix，ecm)(如透明质酸、胶原、纤连蛋白)组成。胰腺癌基质高度纤维化，纤维化成分可高达肿瘤体积的90％。致密的纤维基质可挤压血管，使血管塌陷、血灌注降低。pet/ct结果显示：胰腺癌患者肿瘤血供仅为正常胰腺的1/3。此外，裹挟在肿瘤细胞周围的致密纤维基质具有极低可渗透性，严重制约化疗药物向肿瘤细胞的递送。

3、近年来，调控胰腺癌纤维屏障的策略主要分为两种：其中之一是直接清除一种或几种细胞外纤维基质成分，例如降解、破坏透明质酸、胶原蛋白、纤连蛋白等成分；另一种是将活化成纤维细胞调控至静息态，使其分泌更少纤维基质。两种策略都可以降低胰腺癌组织纤维含量，舒张被挤压的血管，改善化疗药物递送及疗效。然而，第一种策略会破坏肿瘤内稳态，具有增强肿瘤侵袭性和转移性的风险。静息活化成纤维细胞存在于正常胰腺组织，只分泌少量维持组织正常形态所需的纤维成分。因此，第二种策略将活化成纤维细胞调控至静息态，不会破坏肿瘤内稳态，是一种更安全的策略。

4、全反式维甲酸(all-trans retinoic acid，atra)是维生素a的天然衍生物。近年来，多项研究发现：atra通过配体-受体作用连接活化成纤维细胞核上的维甲酸受体(retinoic acid receptors，rars)，将其调控至静息态。然而，atra是一种脂溶性小分子化合物，静脉注射后消除迅速，血中半衰期不足1h。此外，体内正常细胞中广泛存在rars，atra可产生多种“脱靶”副反应，如粘膜皮肤细胞毒、软骨生成抑制、高甘油三酯血症等。这导致atra难以在胰腺癌活化成纤维细胞达到有效浓度，制约其调控效果。

技术实现思路

1、递送效率低显著制约atra在治疗胰腺癌中的应用。针对上述问题，本发明提供了一种可靶向递送atra的fap可活化脂质体frlip@r，可将atra高效递送至体内活化成纤维细胞，将其调控至静息态，降低肿瘤纤维成分含量，改善化疗药物递送及疗效。所述脂质体frlip@r制备方法简便，具有较高atra包载能力和稳定性，且生物相容性和生物安全性良好。

2、本发明的目的可以具体通过以下技术方案实现：

3、本发明第一方面，提供一种可靶向递送atra的fap可活化脂质体frlip@r，所述脂质体可以调控肿瘤相关成纤维细胞，使其恢复至静止态，降低纤维成分含量，以增强化疗药的递送及疗效。

4、进一步地，所述脂质体frlip@r的粒径为30～100nm。

5、进一步地，所述脂质体frlip@r包封率可达60％以上。

6、本发明第二方面，提供一种所述脂质体frlip@r的制备方法，所述方法包括以下步骤：

7、(1)通过反相微乳法制备磷酸钙(cap)核；

8、(2)将cap核、脂质成分和atra溶解于氯仿，通过薄膜水化法制备脂质体lip@r，通过离心除去未包裹药物；

9、(3)通过固相多肽合成法合成fap-r12肽；

10、(4)将fap-r12多肽与lip@r混合，通过点击化学反应修饰多肽，制得frlip@r，通过超滤除去未反应多肽。

11、进一步地，步骤1中所述的cap核制备过程包括：将na2hpo4加入到环己烷/igepalco-520中，得到磷相。然后，将dopa溶液加入磷相中。将cacl2溶解在等体积的环己烷/igepal co-520中，获得钙相。将磷相和钙相混合均匀，形成cap核。然后，将无水乙醇加入乳液中，离心除去环己烷/igepal co-520。用乙醇反复洗涤三次，获得cap核，储存于氯仿，备用。

12、更进一步地，步骤1中所述的na2hpo4与环己烷/igepal co-520的投料体积比为15：1(μl/ml)；其中na2hpo4的浓度为12.5mm，环己烷与igepal co-520的体积比为7：18。

13、更进一步地，步骤1中所述的cacl2与环己烷/igepal co-520的投料比为15：1(μl/ml)；其中cacl2的浓度为2.5m，环己烷与igepal co-520的体积比为7：18。

14、进一步地，步骤1中所述的na2hpo4与dopa的体积比为3：1。

15、进一步地，步骤2中所述的脂质成分包括dotap、胆固醇、dspe-peg2000和dspe-peg3400-mal，更具体的投料摩尔比为1：1：0.47：0.13。

16、进一步地，步骤2中所述的cap核、脂质成分和atra的投料质量比为114～240：25～40：1。

17、进一步地，步骤2中所述的制备过程包括：将cap核、dotap、胆固醇、dspe-peg2000、dspe-peg3400-mal及atra全部溶解于氯仿。然后，在真空下，通过旋转蒸发除去氯仿，以获得脂质膜。用磷酸盐缓冲液(pbs，ph＝7.4)水化脂质膜。将脂质体粗混悬液超声处理，以降低脂质体尺寸。在5000rpm下，离心10分钟以除去未包裹的药物，制得lip@atra。

18、进一步地，步骤3中所述的fap-r12肽为suc-e11-c6-(ggpag)-r12-c6-cys。

19、进一步地，步骤4中所述的多肽修饰过程包括：

20、将fap-r12肽加入lip@atra中，将ph调节至7.2～8.0，并在室温下反应12小时。然后，通过超滤去除未反应fap-r12肽，即得frlip@r。

21、进一步地，步骤4中所述的fap-r12肽按巯基/马来酰亚胺摩尔比为1～10：1进行投料。

22、本发明第三方面，提供本发明所制备脂质体frlip@r在治疗胰腺癌中的应用。

23、进一步地，所述脂质体frlip@r可被活化成纤维细胞表面高表达的fap活化，暴露穿膜肽，实现atra高效细胞摄取。

24、进一步地，所述脂质体frlip@r进入细胞后，cap内核可溶解于酸性内涵体，促使脂质体解体，内涵体破裂，将atra释放于胞浆。

25、进一步地，所述脂质体frlip@r通过高效递送atra至活化成纤维细胞，可将其调控至静息态，减少胰腺癌纤维基质分泌。

26、进一步地，所述脂质体可促进化疗药在胰腺癌的递送及抗肿瘤效果，显著延长小鼠生存期。

27、进一步地，所述脂质体frlip@r具有良好生物相容性和生物安全性。

28、与现有技术相比，本发明具有以下效果：

29、所述脂质体frlip@r可被活化成纤维细胞表面fap活化，脱卸配体中荷负电聚谷氨酸片段，暴露细胞穿膜肽r12；然后，r12可刺激活化成纤维细胞巨胞饮通路，促进脂质体细胞摄取效率；在内涵体酸性微环境下，cap溶解，促进脂质体解体，使内涵体破裂，从而实现溶酶体逃逸，将atra释放于胞浆。通过将atra靶向、高效递送至体内活化成纤维细胞，frlip@r可将其调控至静息态，从而降低胰腺癌基质纤维含量，促进化疗药物递送。本发明所述脂质体与吉西他滨联用在小鼠原位胰腺癌模型中具有比1.5倍剂量吉西他滨更优疗效。并且，所述脂质体frlip@r未引起明显血液、器官毒性，具有良好生物安全性。