噬菌体制剂及其制备方法和应用

本发明涉及微生物，特别涉及噬菌体制剂及其制备方法和应用。

背景技术：

1、嗜水气单胞菌(aeromonas hydrophila，a.hydrophila)是典型的人-家畜-水生动物共患的条件性病原菌，其广泛存在于各种水环境中，可感染各种水产动物，并引发鱼类出现出血性败血症、细菌性肠炎等疾病，嗜水气单胞菌对公共环境与兽医卫生安全已造成严重威胁。在对嗜水气单胞菌病进行预防与治疗过程中，主要依赖于大量抗生素。抗生素使用方法的不当造成鱼机体变化出现抗药性及药物残留等问题十分常见。对全世界水产养殖业的危害巨大的同时也会影响相关水环境的污染，引起的经济损失也不可忽视，许多国内外科研学者对此尤为重视。对鱼类的免疫器官及免疫机制进行相关的初步研究可以发现，可以通过诱导机体的免疫性应答，达到有效预防鱼类细菌病害，最好的方案可通过疫苗的接种来完成。

2、噬菌体(bacteriophage)作为细菌的病毒，最早在1915年和1917年间被发现。噬菌体能够以活细菌“为食”，在自然环境中分布极为广泛。不但存在于海洋、土壤和粪便等，甚至在动物及人体内也会存在相对应的噬菌体。噬菌体在地球上存在的数量十分的庞大，能够达到1032种。国际病毒分类委员会(ictv)发布的噬菌体分类原则为：根据噬菌体的形态和结构、宿主菌种类以及核酸类型，将其分为单链dna病毒、双链dna病毒、单链(+)rna病毒、双链rna病毒，共有4个分类单元，分别是目、科、属、种。国际病毒分类委员会的第十次病毒分类报告将病毒重新划分为：9目、131科、46亚科、803属、4853种。噬菌体通常由蛋白质外壳(衣壳)和核酸(dna或rna)所组成，由于噬菌体蛋白质衣壳的不同，形成了噬菌体的多样性。在电子显微镜下，噬菌体有三种基本形态：蝌蚪形、微球形和丝状。通常根据噬菌体形态及其特点，将噬菌体分为有尾噬菌体、无尾噬菌体和丝状噬菌体三种类型。已报道的噬菌体中，有尾噬菌体最多，由一个包裹着遗传物质的二十面体头部和辅助运动及侵染宿主细胞的尾部组成。由噬菌体头部保护的遗传物质主要分为四种类型，即单链或双链的dna或rna分子。噬菌体的尾部结构包括尾领、尾鞘、尾板、尾刺和尾丝，不同类型的噬菌体具有完整程度不同的尾部结构。

3、目前，水产养殖领域在开发基因工程疫苗和自然减毒疫苗、dna疫苗和亚单位疫苗方面进行了大量研究。其中减毒疫苗会出现毒力回升的缺点；dna疫苗制备成本高，运输条件苛刻等。针对以上缺点制备出免疫保护率高、免疫持续时间长并且性价比高的水产疫苗成为关键性因素。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了噬菌体制剂及其制备方法和应用。本发明噬菌体制剂具有完整的抗原结构，并且可以诱导机体的体液免疫和细胞免疫，也增强了鱼粘膜免疫反应，在腹腔注射免疫鲫鱼后诱导其发生免疫应答，产生特异性免疫球蛋白并提高免疫酶类的活性，有效促进各组织中细胞因子的表达水平，实际应用来看噬菌体制剂极具潜力，可以切实提升鲫鱼的机体免疫力。为嗜水气单胞菌疫苗提供更好的解决方案和理论指导，为噬菌体水产疫苗的研发提供理论依据。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了噬菌体pzy-ah在制备预防和/或治疗嗜水气单胞菌感染的噬菌体制剂中的应用；

4、所述噬菌体pzy-ah的保藏编号为：cctcc no:m 2021691。

5、本发明还提供了噬菌体制剂，包括噬菌体pzy-ah、嗜水气单胞菌和四环素；

6、所述噬菌体pzy-ah的保藏编号为：cctcc no:m 2021691。

7、本发明还提供了所述噬菌体制剂的制备方法，包括如下步骤：

8、步骤1、取所述嗜水气单胞菌，培养，与所述噬菌体pzy-ah进行混匀培养，离心；

9、步骤2、取步骤1所述离心后的沉淀，重悬后与所述四环素混合，静置，离心，弃上清，制得所述噬菌体制剂。

10、在本发明的一些具体实施方案中，所述噬菌体pzy-ah与所述嗜水气单胞菌的浓度比包括1pfu/ml:10cfu/ml。

11、在本发明的一些具体实施方案中，步骤1所述培养的时间包括6h。

12、在本发明的一些具体实施方案中，步骤1所述混合培养的时间包括4h。

13、在本发明的一些具体实施方案中，以ml/μl计，步骤2所述离心后的沉淀重悬后的溶液和所述四环素的体积比包括1：6；

14、所述四环素的浓度包括0.01g/ml。

15、在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法包括如下步骤：

16、步骤1、取所述嗜水气单胞菌于液体培养基中，培养6h后，和所述噬菌体pzy-ah进行混匀培养4h，离心；

17、步骤2、取步骤1离心后的沉淀，重悬后和0.01g/ml四环素混合，静置15min，离心，弃上清，获得所述噬菌体制剂；

18、所述所述噬菌体pzy-ah和所述嗜水气单胞菌的浓度比包括1pfu/ml:10cfu/ml；

19、以ml/μl计，步骤2所述重悬后的溶液和所述四环素的体积比包括1：6。

20、本发明还提供了所述噬菌体制剂或所述制备方法制得的噬菌体制剂在制备提高机体对嗜水气单胞菌的免疫力的产品中的应用。

21、在本发明的一些具体实施方案中，所述提高机体对嗜水气单胞菌的免疫力包括提高机体中细胞因子的水平。

22、在本发明的一些具体实施方案中，所述细胞因子包括igm、cat、lzm、sod、akp、acp、c3、c4、il-10、il-1β、tgf-β、tnf-a或ifn-y中的一种或多种。

23、本发明还提供了所述噬菌体制剂或所述制备方法制得的噬菌体制剂在制备治疗或预防由嗜水气单胞菌引起的疾病的产品中的应用。

24、在本发明的一些具体实施方案中，所述疾病包括败血症、出血病或肠胃炎中的一种或多种。

25、在本发明的一些具体实施方案中，所述产品包括疫苗。

26、本发明包括但不限于提供了如下有益效果：

27、本发明以鲫鱼源嗜水气单胞菌为宿主菌，从污水中分离获得的一种对嗜水气单胞菌具有杀伤活性的噬菌体，本发明为了制备出免疫保护率高、免疫持续时间长并且性价比高的水产疫苗，通过使用该噬菌体对宿主菌进行裂解，探索出合适的条件，从而制备噬菌体裂解液疫苗。创制的噬菌体裂解液疫苗具有完整的抗原结构，并且可以诱导机体的体液免疫和细胞免疫，也增强了鱼粘膜免疫反应，在腹腔注射免疫鲫鱼后诱导其发生免疫应答，产生特异性免疫球蛋白并提高免疫酶类的活性，有效促进各组织中细胞因子的表达水平，实际应用来看噬菌体裂解液疫苗极具潜力，可以切实提升鲫鱼的机体免疫力。为嗜水气单胞菌疫苗提供更好的解决方案和理论指导，为噬菌体水产疫苗的研发提供理论依据。

技术特征：

1.噬菌体pzy-ah在制备预防和/或治疗嗜水气单胞菌感染的噬菌体制剂中的应用；

2.噬菌体制剂，其特征在于，包括噬菌体pzy-ah、嗜水气单胞菌和四环素；

3.如权利要求2所述噬菌体制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述噬菌体pzy-ah与所述嗜水气单胞菌的浓度比包括1pfu/ml:10cfu/ml。

5.如权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，步骤1所述培养的时间包括6h。

6.如权利要求3至5任一项所述制备方法，其特征在于，步骤1所述混合培养的时间包括4h。

7.如权利要求3至6任一项所述制备方法，其特征在于，以ml/μl计，步骤2所述离心后的沉淀重悬后的溶液和所述四环素的体积比包括1：6；

8.如权利要求2所述的噬菌体制剂或如权利要求3至7任一项所述制备方法制得的噬菌体制剂在制备提高机体对嗜水气单胞菌的免疫力的产品中的应用。

9.如权利要求2所述的噬菌体制剂或如权利要求3至7任一项所述制备方法制得的噬菌体制剂在制备治疗或预防由嗜水气单胞菌引起的疾病的产品中的应用。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述疾病包括败血症、出血病或肠胃炎中的一种或多种。

技术总结本发明涉及微生物技术领域，特别涉及噬菌体制剂及其制备方法和应用。本发明提供了噬菌体制剂及其制备方法和应用。本发明噬菌体制剂具有完整的抗原结构，并且可以诱导机体的体液免疫和细胞免疫，也增强了鱼粘膜免疫反应，在腹腔注射免疫鲫鱼后诱导其发生免疫应答，产生特异性免疫球蛋白并提高免疫酶类的活性，有效促进各组织中细胞因子的表达水平，实际应用来看噬菌体制剂极具潜力，可以切实提升鲫鱼的机体免疫力。为嗜水气单胞菌疫苗提供更好的解决方案和理论指导，也为噬菌体水产疫苗的研发提供理论依据。技术研发人员：张蕾,孙武文,梁芮萁受保护的技术使用者：吉林农业大学技术研发日：技术公布日：2024/6/11