基于随机结构光照明的动态散斑宽场荧光成像系统

本发明涉及的是基于随机结构光照明的动态散斑宽场荧光成像系统，将结构光照明和动态散斑照明方法结合在一起，包含散斑图案的结构光条纹，通过显微物镜投射到待测生物样品上，依次改变光栅的位置，当光栅移动至一个位置后连续移动散射体，由cmos相机记录多幅动态变化的散斑照明荧光图像，通过四步相移法和均方根算法获得具有高三维空间分辨率的荧光图像，可用于对活体单细胞或生物组织的三维结构高空间分辨率显微成像，获得更为清晰的层析分辨图像，属于生物光子学领域。

背景技术：

1、21世纪是生命科学的世纪。人们对生命的认识从细胞开始，遵循着由宏观向微观，由整体向局部，从个体到器官、组织、细胞、细胞器、乃至组成生命的基本物质——分子这样一个过程逐步展开。细胞作为生命结构和功能的基本单位，对其进行深入研究是揭示生命现象奥秘、征服疾病和改造生命的关键。

2、光学显微成像技术的出现，对有机体的遗传、发育以及生理机能的了解，和作为医疗基础的病理学、药理学等以及农业的育种等，对单个细胞的观察都起着至关重要的作用。光学显微成像技术是指透过样品或从样品反射回来的可见光，通过一个或多个透镜后，能够得到微小样品的放大图像的技术。所得图像可以通过目镜直接用眼睛观察，也可以用数字化图像探测器进行记录，还可以在计算机上进行显示和分析处理，是研究更为方便。

3、传统的宽场荧光显微镜通过物镜将激发光聚焦，同时收集样品的荧光信号成像。观察其照明方式不难发现，虽然焦平面上的光最强，但其上下的样品也会被照亮，导致以下局限性：引入额外的光毒性，影响样品生物活性，甚至造成细胞的死亡；成像焦平面以外的干扰信号进入图像，导致图像分辨率和反差降低。

4、近年来，基于荧光显微成像技术、激光扫描共焦显微镜结构光照明成像技术已经成为研究细胞的重要工具。荧光显微成像技术是以紫外线为光源，并用其照射被检物体，使被检测物体发出荧光，最后可以在显微镜下观察物体的形状和具体位置。荧光显微镜的空间分辨率由阿贝衍射极限决定。这种阿贝衍射极限适用于倾斜均匀照明、远场光学照明和探测以及线性吸收和发射区域。在细胞生物学中有着广泛的应用。同时具有高特异性，高空间分辨率，以及三维层析成像能力等特点。但是外源荧光标记必然会影响细胞的自身性质和生命活动过程，甚至会产生光致毒性，荧光团自身的光致漂白等，荧光显微成像技术无法回避的问题。

5、具有层析分辨能力光学显微镜的出现对显微镜成像技术的发展具有划时代的意义，该显微镜的出现使得细胞和组织的光学连续切片和三维结构重建能够得以实现，为研究提供了重要的工具。激光扫描共聚焦荧光显微镜是在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激光荧光探针，利用计算机进行图像处理，不仅可观察固定的细胞、组织切片，还可对活细胞的结构、分子、离子进行实时动态地观察和检测。与普通的宽场荧光显微成像方法相比，它的优点是可以有效提高图像的空间分辨率和成像质量，具有深层分辨和三维层析成像的能力。缺点是系统结构复杂、造价昂贵，并且成像速度较慢。

6、近年来，动态散斑显微成像技术的出现解决了这一难题。该成像方法不仅具有层析分辨能力，而且采用宽场的成像方法，不需要复杂的装置，成像速度快、成本低廉。

7、动态散斑显微成像技术虽然具有层析分辨的能力，但是为了获得待测物体的三维结构需要获得多层的层析图像，这就需要不断调整显微镜的聚焦位置，操作十分不方便。本发明则是利用不断调整光栅的位置来实现多层面的层析图像，而实现此目标需要用到结构光照明中的四步相移法。结构光照明是一种通过改变照明光空间结构的照明方式，通常照明的结构光是一个载频条纹，该照明方式可应用于角度、长度、振动等的测量，并广泛应用于三维成像。这种特别的照明方式通过形成摩尔纹来使得在常规照明方式下无法分辨的一些高分辨率信息得以变得可见。

8、基于光栅投影测量方法是结构光照明中的一种，也是近年来发展起来的具有代表性的一种三维视觉技术。实际实验过程中在照明光路中插入一个如光栅，照明光受光栅的调制后经物镜投影在样品上，这样在样品的焦平面收到调制光的照射，在远离焦平面也不受影响，最终调制光所产生的荧光信息通过成像系统被ccd接收，之后通过傅里叶变换将空间域和频域进行变化，从而获得图像。这种测量方法具有非接触、成本低和精度高等优点。在数字光栅投影测量方法中最为常用的算法是相移算法。本发明采用的就是相依算法中的四步相移法，该方法具有高分辨率、高精度、算法简单和处理速度快等优点。近年来，广泛应用于光学三维测量与成像领域。

9、本发明涉及的是一种基于随机结构光照明的动态散斑宽场荧光成像系统。该系统采用结构光照明中的四步相移法，系统中需要用到一个光栅，光栅旋转四次，每次旋转90度并达到稳定状态后，使用动态散斑照明的宽场荧光显微成像技术获取细胞的层析图像。通过获得不同角度上的细胞层析图像，最终获得高分辨率的细胞三维结构图像。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种成像速度快、分辨率高、结构简单、无需外援标记等成像优点的一种基于随机结构光照明的动态散斑宽场荧光成像系统。

2、本发明的目的是这样实现的：

3、当待测样品被动态散斑照射时，细胞内的荧光标记染料被激发并发出荧光，荧光通过检测物镜收集并传送到cmos相机，实现细胞的成像。本发明采用四步相移法，分四次，每次间隔90°移动光栅5的位置，分别在四个不同的相移位置，用cmos相机捕获细胞的图片。

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8、式(3)-(6)中，a(x,y)为背景光强；b(x,y)为物体表面的反射率；f为光栅条纹的空间频率；为被截断在(－π，+π]的相位主值。

9、在基于随机结构光照明的动态散斑宽场荧光成像系统中，当激光束通过一个光栅5和不断改变的散射体7时，会在复消色差显微物镜15的后焦面形成一系列随机变化的散斑图案，这些散斑图案用来照明待测细胞16。待测细胞16受激发后产生的荧光信号分为两个来源，一个是来自复消色差显微物镜15视场焦平面上的荧光信号，另一个则是来自于复消色差显微物镜15视场焦平面以外的背景荧光信号。随着照明散斑图案的改变，散斑照明产生的散粒状分布的荧光强度在复消色差显微物镜15焦平面内发生剧烈变化，而在视场焦平面外的地方却变化缓慢，这种信号特征是实现层析成像的基础。通过cmos相机11记录待测细胞16特定层上一系列变化的散斑图案，利用特殊的算法能够提取该层面的荧光信号，从而具有层析成像功能。

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11、式(2)中，n为图像序列中图像数，ii为第i幅图像的强度，irms为采集得到n幅图像的均方根图像，也就是层析成像，n一般取50-60就可以得到比较清晰的荧光层析图像。

12、一种基于随机结构光照明的动态散斑宽场荧光成像系统，其特征是：所述系统主要由激光光源1；透镜2，3，8，9；微位移台4，6；光栅5；散射体7；电脑10；cmos相机11；成像镜头12；滤光片13；双色镜14；复消色差显微物镜15；待测细胞16；载物台17组成。所述系统中激光光源1发出的激光光束经透镜2和3扩束后投射到光栅5上，然后再经散射体7形成包含散斑图案的结构光条纹，再经过透镜8和9扩束，经双色镜14反射后在复消色差显微物镜15后焦平面上形成散斑图案的像，经复消色差显微物镜15在待测细胞16上形成全场照明；通过移动微位移台4来改变光栅5的位置，实现四步相移法，在每个相移位置处移动微位移台6来改变散射体7的位置，使投射在待测细胞16上的包含散斑图案的结构光条纹发生变化，实现随机结构光照明；随机结构光激发产生的荧光信号由复消色差显微物镜15收集，经双色镜14和滤光片13消除背景噪声，经成像镜头12由cmos相机11记录，通过计算机10采用四步相移法和均方根算法提取焦平面内待测细胞或生物组织的荧光信号，进而获得待测样品的具有高空间分辨率的三维结构荧光层析图像。