显微镜装置及图像获取方法与流程

本公开涉及一种显微镜装置及图像获取方法。

背景技术：

1、专利文献1公开了饱和激励(saturated excitation：sax)显微镜。在该文献中，以作为激励光的激光的强度的时间变化成为余弦波的方式调制激光。

2、非专利文献1和2公开了将sax显微镜和二光子激励显微镜进行组合。在这些文献中，以激励光的强度的时间变化成为正弦波的方式调制激励光的强度。

3、现有技术文献

4、专利文献

5、专利文献1：国际公开第2006/061947号

6、非专利文献

7、非专利文献1：sandeep chakraborty et al.,"saturated two-photonexcitation fluorescence microscopy for the visualization of cerebral neuralnetworks at millimeters deep depth",journal of biophotonics,august 2018

8、非专利文献2：anh dung nguyen et al.,"3d super-resolved in vitromultiphoton microscopy by saturation of excitation",optics express volume 23,issue 17pp.22667-22675(2015)

技术实现思路

1、发明所要解决的问题

2、一般地，在sax显微镜中，通过向观察对象物照射具有正弦波状的时间波形的激励光，激励观察对象物并输出荧光，并且使激励光的峰强度大于观察对象物的饱和激励强度，从而使荧光的峰强度饱和。再者，检测包含于荧光的时间波形的谐波分量，例如第2谐波，并基于该谐波分量作成观察图像。由此，能够提高观察图像的空间分辨率。

3、在多光子激励显微镜中，将例如近红外光等长波长的超短脉冲光作为激励光向观察对象物照射，在观察对象物产生二光子激励等多光子激励，检测由此产生的荧光，并作成观察图像。根据该多光子激励显微镜，由于使用物体透过性优异的长波长的光，因此能够无创地观察例如生物体组织的深部。

4、通过将具有上述的各优点的sax显微镜和多光子激励显微镜组合，可以实现兼具这些优点的显微镜。然而，在n光子激励(n为2以上的整数)中，荧光强度与激励光强度的n次方成比例。因此，如果向观察对象物照射具有正弦波状的时间波形的激励光，并且在观察对象物产生n光子激励，则从观察对象物输出的荧光的时间波形与正弦波的n次方成比例。如果要基于具有这样的时间波形的荧光强度来获得观察图像，则例如在专利文献2所记载的那样，需要检测第3谐波、第5谐波等次数高的谐波。由于检测荧光的器件的频率范围有限度，因此如果要检测次数高的谐波，则不得不减小激励光的频率，观察图像的作成所需的时间变长。或者，不得不导入频率范围的上限高的设备，成本变高。

5、本公开鉴于这样的问题点而完成，其目的在于，提供一种显微镜装置及图像获取方法，其能够具有sax显微镜和多光子激励显微镜这两者的优点，并且使用次数较低的谐波作成观察图像。

6、用于解决问题的技术手段

7、为了解决上述的课题，本公开的显微镜装置具备激励光输出部、光学系统和谐波检测部。激励光输出部输出激励光。激励光的光强度的时间波形包含正弦波的一次函数的n次方根(n为2以上的整数)。激励光的光强度的最大值超过观察对象物的饱和激励强度。光学系统将从激励光输出部输出的激励光照射于观察对象物。谐波检测部检测包含于荧光的光强度的时间波形的第2谐波，荧光通过利用激励光的照射的n光子激励而在观察对象物产生。

8、本公开的图像获取方法包括激励光输出步骤、激励光照射步骤、谐波检测步骤和图像生成步骤。在激励光输出步骤中，输出激励光。激励光的光强度的时间波形包含正弦波的一次函数的n次方根(n为2以上的整数)。激励光的光强度的最大值超过观察对象物的饱和激励强度。在激励光照射步骤中，将在激励光输出步骤中输出的激励光照射于观察对象物。在谐波检测步骤中，检测包含于荧光的光强度的时间波形的第2谐波，荧光通过利用激励光的照射的n光子激励而在观察对象物产生。在图像生成步骤中，基于第2谐波生成观察对象物的观察图像。

9、在这些显微镜装置及图像获取方法中，激励光强度的时间波形包含正弦波的一次函数的n次方根。如前述那样，在n光子激励中，荧光强度与激励光强度的n次方成比例。因此，如果向观察对象物照射具有包含正弦波的一次函数的n次方根的时间波形的激励光，并在观察对象物产生n光子激励，则从观察对象物输出的荧光的时间波形，不是正弦波的n次方，而是与正弦波的一次函数成比例。因此，与一般的sax显微镜同样，能够基于第2谐波或第3谐波等次数更低的谐波来获得观察图像。因此，根据这些显微镜装置及图像获取方法，不需要由于检测荧光的器件的频率范围的制约而减小激励光的频率，因此能够避免观察图像的作成所需的时间变长。或者，由于能够使用频率范围低的设备，因此带来成本降低。

10、在上述的显微镜装置中，激励光输出部也可以具有：光源，其输出脉冲光；以及强度调制型的光调制器，其调制从光源输出的脉冲光并生成激励光。同样，在上述的图像获取方法中，激励光输出步骤也可以包括调制脉冲光并生成激励光的强度调制步骤。根据这样的结构及方法，能够容易生成在光强度的时间波形中包含正弦波的一次函数的n次方根的激励光。在该情况下，光调制器也可以是ao调制器。

11、在上述的显微镜装置中，光源也可以是激光光源。同样，在上述的图像获取方法中，脉冲光也可以是激光。由此，能够通过简易的结构生成可以产生n光子激励的具有大的光强度的激励光。

12、在上述的显微镜装置及图像获取方法中，激励光的光强度的时间波形中的各周期内的最小值也可以大于0，或者，也可以大于谐波检测部或在谐波检测步骤中能够接收的最大信号的0.1％且小于20％。在激励光强度的时间波形中的各周期内的最小值及其附近，产生的荧光的强度微小，其检测结果受到噪声的影响大。通过使激励光强度的时间波形中的各周期内的最小值大于0，能够减小噪声的影响并提高第2谐波的检测精度，使观察图像更清晰。或者，通过使激励光强度的时间波形中的各周期内的最小值大于谐波检测部或在谐波检测步骤中能够接收的最大信号的0.1％且小于20％，能够减小噪声的影响并提高第2谐波的检测精度，使观察图像更清晰。在激励光强度的时间波形包括正弦波的一次函数的平方根的情况下，与激励光强度的时间波形为正弦波的情况比较，各周期内的最小值附近的光强度的变化率变大。换言之，各周期内的最小值附近的光强度的时间波形变得陡峭。再者，在各周期内的最小值为0的情况下，该变化率最大。通过使各周期内的最小值大于0，能够减小各周期内的最小值附近的光强度的变化率，缓和时间波形的陡峭。或者，通过使各周期内的最小值大于谐波检测部或在谐波检测步骤中能够接收的最大信号的0.1％且小于20％，能够减小各周期内的最小值附近的光强度的变化率，缓和时间波形的陡峭。由此，激励光输出部中的激励光强度的时间波形的成形，特别是各周期内的最小值附近的时间波形的成形变得容易。

13、在上述的显微镜装置中，谐波检测部也可以具有：光检测器件，其生成与在观察对象物产生的荧光的光强度对应的信号；以及锁相放大器，其从光检测器件输入信号，并且输出包含于信号的时间波形的第2谐波。同样，在上述的图像获取方法中，谐波检测步骤也可以包括：生成与在观察对象物产生的荧光的光强度对应的信号的步骤；以及输出包含于信号的时间波形的第2谐波的步骤。通过这些结构及方法，能够简易且高精度地检测第2谐波。

14、在上述的显微镜装置中，谐波检测部也可以进一步检测包含于在观察对象物产生的荧光的光强度的时间波形的第3谐波。同样，在上述的图像获取方法中，也可以在谐波检测步骤中，进一步检测包含于在观察对象物产生的荧光的光强度的时间波形的第3谐波。再者，也可以在图像生成步骤中，基于第2谐波和第3谐波中的一者或两者，生成观察对象物的观察图像。在该情况下，能够简便地生成根据第2谐波和第3谐波中适于观察对象物的谐波的观察图像。

15、在上述的显微镜装置及图像获取方法中，也可以是从激励光输出部输出的激励光的光强度的时间波形包含正弦波的一次函数的平方根，谐波检测部或谐波检测步骤检测包含于荧光的光强度的时间波形的第2谐波，荧光通过利用激励光的照射的二光子激励而在观察对象物产生。

16、本公开的激励光输出装置在荧光显微镜中使用，该荧光显微镜基于通过利用激励光的照射的二光子激励而在观察对象物产生的荧光的光强度的时间波形，生成观察图像。该激励光输出装置输出激励光，该激励光的光强度的时间波形包含正弦波的一次函数的平方根，并且该激励光的光强度的最大值超过观察对象物的饱和激励强度。本公开的激励方法是荧光显微镜中的激励方法，该荧光显微镜基于通过利用激励光的照射的二光子激励而在观察对象物产生的荧光的光强度的时间波形，生成观察图像。在该激励方法中，将激励光照射于观察对象物并激励观察对象物，该激励光的光强度的时间波形包含正弦波的一次函数的平方根，该激励光的光强度的最大值超过观察对象物的饱和激励强度。

17、在这些激励光输出装置及激励方法中，激励光强度的时间波形包含正弦波的一次函数的平方根。如前述那样，在二光子激励中，荧光强度与激励光强度的平方成比例。因此，如果向观察对象物照射具有包含正弦波的一次函数的平方根的时间波形的激励光，并在观察对象物产生二光子激励，则从观察对象物输出的荧光的时间波形，不是正弦波的平方，而是与正弦波的一次函数成比例。因此，能够基于第2谐波或第3谐波等次数更低的谐波来获得观察图像。因此，根据这些激励光输出装置及激励方法，不需要由于检测荧光的器件的频率范围的制约而减小激励光的频率，因此能够避免观察图像的作成所需的时间变长。或者，由于能够使用频率范围低的设备，因此带来成本降低。

18、发明的效果

19、根据本公开，能够提供一种显微镜装置及图像获取方法，其能够具有sax显微镜及多光子激励显微镜这两者的优点，并且使用次数较低的谐波作成观察图像。