用于具有各向同性空间分辨率的三维结构照明显微术的系统和方法与流程

本公开文本总体上涉及具有几乎各向同性的或各向同性的空间分辨率的三维结构照明显微术(3d sim)系统；并且具体地，涉及通过将反射镜定位成与物镜在直径上相对以便隔离3d sim光学系统中的中心照明束来改善3d sim中的空间分辨率的系统和方法，所述中心照明束产生四束干涉图案以增加轴向空间分辨率。

背景技术：

1、三维结构照明显微术(3d sim)提供了光学切片的超分辨率显微术，其在所有三个空间维度上具有宽场荧光显微术的约两倍的分辨率。这种能力通过典型地经由单个物镜向样品引入周期性的衍射极限的照明结构来实现。受标记的样品与这种照明结构的相乘得到了在衍射极限通带之外的附加信息，所述附加信息被编码在由样品的一系列衍射极限图像捕获的荧光中。然后可以数学上地对这种信息进行解码，以得到样品的超分辨率重构。对于薄样品，3d sim相对于其他形式的超分辨率显微术(例如，定位显微术、受激发射损耗显微术)提供了优势，这是由于其相对较低的照明剂量(使得在活细胞中能够进行体积成像)以及与任意荧光团的兼容性(促进了多色超分辨率成像)。

2、尽管轴向维度上的分辨率增强是衍射极限宽场显微术的两倍，但使用高数值孔径(na)光学器件的3d sim的绝对轴向分辨率仍然限制在约300nm。这比衍射极限显微术中的侧向分辨率更差，因此令人期望的是找到改善常规3d sim中的轴向分辨率的方法，理想上使其与侧向分辨率程度相同。

3、在任何常规单物镜3d sim显微镜中轴向分辨率比侧向分辨率差的原因是因为照明结构本身有衍射极限，并且因此沿着轴向维度的粗糙程度是侧向维度的约2-3倍。如图1a所示，照明中的这种各向异性可以通过意识到相互干涉以产生3d sim照明图案的三个照明波矢量(1、2和3)位于由物镜的na确定的球冠上来理解。任何波矢量对(1与2、1与3、2与3)之间的差异确定了照明的空间频率。纯侧向照明频率由波矢量1与3(即，那些产生在球冠外围的波矢量，并且其差异大于由波矢量1与2(或波矢量2与3)之间的差异确定的轴向照明频率)之间的差异给出。

4、图1a进一步示出了照明波矢量1、2和3，而图1b示出了那些照明波矢量1、2和3在常规单物镜3d sim显微镜中的空间频率分量。图1a还示出了位于由物镜的na(＝n sinθ)确定的球冠上的常规3束sim中的照明波矢量。图1b和图8展示了任何波矢量对(1与2、2与1、1与3、3与1、2与3、3与2，或任何波矢量与自身)之间的相应差异，所述差异产生了所得照明图案140的七个照明分量150(黑点)，例如，代表轴上中心照明分量150a和离轴照明分量150b和150c的照明分量150a-150c。应注意，纯侧向(沿着kx轴)空间频率大于轴向空间频率(其振幅沿着kz轴的那些)，因为前者是由于外围波矢量1与3之间的较大差异引起的，而后者是由中心波矢量与外围波矢量(1与2、或2与3)之间的较小差异确定的。

5、以上图示和推理表明，改善轴向分辨率的一种方法将是增加样品照明中“轴向定向”的波矢量的数量。在照射期间来自这种额外波矢量的干涉可以用来增加空间频率在轴向方向上的数量和振幅，这进而将改善常规3d sim中的轴向分辨率。

6、这一概念已在“i5s”显微术中得以探索，其中使用两个直径上相对的物镜引入六个相互相干的照明波矢量，其干涉图案得到19个照明频率分量，而不是单物镜3d sim中的7个。沿着轴向维度的额外频率分量产生的轴向结构与单物镜3d sim中的侧向结构一样精细。这个特性以及i5s中荧光发射也被相干地干涉的事实得到了各向同性的约100nm的空间分辨率，将3d sim的体积分辨率提高了多于一倍。

7、然而，i5s也存在若干个显著的缺点，这些缺点极大地阻碍了广泛的应用。首先，用于照明和荧光的两条路径比传统的3d sim需要更多的光学器件，对于光学系统增加了显著的成本和复杂度，并且衰减了灵敏度。其次，并且更重要的是，这些路径必须被仔细对准，并且对准保持远好于一个波长，否则干涉量度的条件可能会漂移或被破坏。在实践中，这需要多个光学元件的主动反馈，进一步增加了仪器的复杂度。第三，样品与浸没流体之间任何折射率不匹配的程度都将引入严重的像差，从而将该技术限制于固定的样品。迄今为止，这些限制使得i5s仅保留于少数实验室内；在实践中，所述方法并未用于生物学研究。

8、最近提出了令人感兴趣的对i5s的替代方案，其中在常规3d sim显微镜中的轴上中心照明束(对应于图1a和图8中的波矢量2)被与样品相对的低na物镜捕获，重新成像到反射镜，并且反射回样品。以此方式，第四反射波矢量与原始的3束图案干涉，由此得到了具有比常规单物镜3d sim中的照明图案更精细的轴向结构的4束干涉图案。这种方法提供的照明频率分量比i5s更少，并且也没有如i5s中那样干涉荧光发射。因此，轴向分辨率的改善程度小于i5s，但理论上与常规3d sim相比仍有实质性的改善；预测的理论轴向分辨率小于150nm。

9、然而，即使是这种简化的设置，也存在显著的挑战。首先，虽然比i5s的光学路径更简单，但反射中心照明束所需的光学器件仍需要稳定的对准，并且相对于单物镜3d sim增加了复杂度(例如，仍然需要两个物镜)。其次，反射的照明束必须两次穿越多个光学元件，给反射束增加了不令人期望的波前畸变。第三，这种畸变也会由空气(放置额外光学元件的介质)和水(放置样品的介质)之间不同的折射率引入。第四，并且也许更重要的是，所需的额外光学路径长度可能跨越将近一米。这意味着照明源(激光器)必须具有至少这个长度的相干长度，以使直接束与反射束之间可能发生干涉。这个条件可能排除了显微术中常用的常见单模式激光源。

10、考虑到这些观察等，设想和开发了本公开文本的各个方面。

技术实现思路

技术特征：

1.一种三维结构照明显微术系统，其包括：

2.根据权利要求1所述的系统，其进一步包括：

3.根据权利要求2所述的系统，其中，所述液晶偏振旋转器可操作以旋转所述样品平面处的所述三个照明束的偏振。

4.根据权利要求2所述的系统，其进一步包括：

5.根据权利要求1所述的系统，其进一步包括：

6.根据权利要求1所述的系统，其进一步包括：

7.根据权利要求2所述的系统，其中，在通过所述液晶偏振旋转器使所述三个照明束的偏振旋转之前，所述三个照明束的所述照明图案进行傅里叶变换。

8.根据权利要求1所述的系统，其中，所述轴上反射照明束是相干束。

9.根据权利要求1所述的系统，其中，由所述空间光调制器生成的所述照明图案产生五个相位和三个取向。

10.一种改善三维结构照明显微术系统(3d-sim)中的空间分辨率的方法，所述方法包括：

11.根据权利要求10所述的系统，其中，所述轴上反射照明束是相干束。

12.根据权利要求10所述的系统，其中，所述三个照明束包括五个相位和三个取向。

13.根据权利要求10所述的系统，其中，所述三个照明束被偏振。

14.根据权利要求13所述的系统，其中，所述三个照明束的偏振被旋转以最大化所述样品平面处的所述照明图案的干涉。

15.一种用于训练神经网络以改善轴向分辨率的系统，所述系统包括：

16.根据权利要求15所述的系统，其中，所述存储器进一步包括指令，所述指令当被执行时使所述处理器：

17.根据权利要求16所述的系统，其中，所述存储器进一步包括指令，所述指令当被执行时使所述处理器：

18.根据权利要求17所述的系统，其中，输入所述多个低分辨率和高分辨率3d-sim图像训练对训练所述神经网络，从而基于由经训练的神经网络评估的低分辨率3d-sim图像来预测和重构3d-sim图像。

19.根据权利要求15所述的系统，其中，类似于产生所述低分辨率3d-sim图像，对沿着所述第一方向和所述第二方向模糊的所述3d-sim图像进行下采样引入像素化。

20.根据权利要求15所述的系统，其中，对沿着所述第一方向和所述第二方向模糊的所述3d-sim图像进行上采样以产生所述低分辨率3d-sim图像生成具有各向同性像素大小的3d-sim图像。

21.根据权利要求16所述的系统，其中，所述高分辨率3d-sim图像当被输入到所述神经网络中时用作地面真值。

22.根据权利要求18所述的系统，其中，所述存储器进一步包括指令，所述指令当被执行时使所述处理器：

23.根据权利要求22所述的系统，其中，所述存储器进一步包括指令，所述指令当被执行时使所述处理器：

24.根据权利要求23所述的系统，其中，所述存储器进一步包括指令，所述指令当被执行时使所述处理器：

25.根据权利要求18所述的系统，其中，所述存储器进一步包括指令，所述指令当被执行时使所述处理器：

26.根据权利要求25所述的系统，其中，所述存储器进一步包括指令，所述指令当被执行时使所述处理器：

27.根据权利要求26所述的系统，其中，所述存储器进一步包括指令，所述指令当被执行时使所述处理器：

28.根据权利要求27所述的系统，其中，所述存储器进一步包括指令，所述指令当被执行时使所述处理器：

技术总结本文公开了对于三维结构照明显微术系统的各种实施方案，所述三维结构照明显微术系统具有定位成与物镜在直径上相对的反射镜，以通过由所述反射镜生成的第四束产生附加照明分量；以及用于实现所述三维结构照明显微术系统的计算装置的各种实施方案。技术研发人员：H·什罗夫,Y·吴,P·拉里维耶尔,X·李受保护的技术使用者：美利坚合众国-由健康及人类服务部部长代表技术研发日：技术公布日：2024/6/11