抗凝血肽的制作方法

专利名称：抗凝血肽的制作方法技术领域：本发明涉及新的抗凝血肽，这些抗凝血肽本身又是开发抗凝剂有价值的试剂。在例如急性深静脉血栓形成、肺栓塞、四肢的急性动脉栓塞形成、心肌梗塞、和散布性血管内血凝固的药物治疗中，抗凝剂是有用的治疗剂。据信抗凝剂的预防性给药可预防患风湿性或动脉硬化性心脏病患者复发栓塞和预防某些外科血栓栓塞并发症。抗凝剂也可用于治疗冠状动脉和脑血管疾病。动脉栓塞形成，特别是发生在供养心肌和脑的动脉中，是死亡的诱因。水蛭素是一种分离自水蛭唾液腺的65个氨基酸残基的多肽。它是一种抗凝血剂，即凝血酶特异性抑制剂。尽管分离自水蛭提取物的水蛭素相当有效，但其临床应用似乎是不可能的，因为其量是有限的，昂贵，和通常在任何这一大小的外来蛋白给药之后出现变态反应。申请人首先发现了一个至少可部分担负其抗凝血活性的水蛭素的特定区域。用化学方法合成了该肽区域(水蛭素的55～65个氨基酸)，该区域可与凝血酶的识别位点结合;该识别位点与酶的切割位点在空间上是截然不同的。合成肽的结合还表明可竞争性防止血纤维蛋白原与凝血酶识别位点的结合，这是血纤维蛋白产生和凝块形成的重要的先决条件，因而其作为抗凝剂具有潜在的医学价值。申请人已进一步制备了在其基本序列中含有单个氨基酸缺失的这种肽的衍生物。具体讲，这一系列氨基酸缺失总地看来可在位置和组成上限定肽的序列依赖性程度，并可为药物的持久合理设计提供基础。许多这种类型的肽类似物具有母体肽的属性，因此也可作为对抗凝血治疗有科学价值和明显疗效的辅助剂。而且，氨基酸类似物本身可具有增强的效力和持久的作用期。下式的肽衍生物是有用的抗凝血剂，X-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-Y其中X是氨基末端残基，选自氢、一个或两个具有1～10个碳原子的烷基，一个或两个具有2～10个碳原子的酰基，苄氧羰基或叔丁氧羰基;A1是水蛭素或其天然变体的序列或该序列的一部分，一个键，或含有1～11个任何氨基酸残基的肽;A2是Phe，SubPhe，PClPhe，Pgl，Tha，His，Nap，β-(2-和3-噻吩基)丙氨酸，β-(2-和3-呋喃基)丙氨酸，β-(2-，3-，和4-吡啶基)丙氨酸，β-(苯并噻吩-2-和-3-基)丙氨酸，β-(1-和2-萘基)丙氨酸，Tyr，I-Tyr，或Trp;A3是一个键，或是Glu，Asp，或Ala;A4是一个键，或是任何氨基酸;A5是一个键，或是Ile，Val，Leu，Nle，Phe，Ala;A6是一个键，或是Pro，Hyp，3，4-dihydroPro，噻唑烷-4-羧酸酯，Sar，NMePgl，Azt，Pip，或D-Ala;A7是一个键，或是任何L-氨基酸;A8是一个键，或是任何L-氨基酸;A9是Tyr，I-Tyr，D-Tyr，His，Ala，Met，Trp，Phe，Leu，Nle，Ile，Val，Cha和Pro或是至少含有这些氨基酸或亲脂性氨基酸之一的二肽;A10是水蛭素或其天然变体的序列或该序列的一部分，一个键或含有1～11个任何氨基酸残基的肽;Y是羧基末端残基，选自OH，(C1-C8)烷氧基，氨基，或单或双(C1-C4)烷基取代的氨基酸;其中在A3至A8中的至少一个位置是一个键。本说明书中所用的(1)氨基酸及其三字母代码，(2)修饰的和异常的氨基酸，和(3)末端氨基和羧基取代基的常用缩写如下(1)氨基酸及其三字母代码L-氨基酸 D-氨基酸Ala(或A)-丙氨酸 D-Ala(或a)-D-丙氨酸Arg(或R)-精氨酸 D-Arg(或r)-D-精氨酸Asn(或N)-天冬酰胺 D-Asn(或n)-D-天冬酰胺Asp(或D)-天冬氨酸 D-Asp(或d)-D-天冬氨酸Cys(或C)-半胱氨酸 D-Cys(或c)-D-半胱氨酸Gly(或G)-甘氨酸Glu(或E)-谷氨酸 D-Glu(或e)-D-谷氨酸Val(或V)-缬氨酸 D-Val(或v)-D-缬氨酸Gln(或Q)-谷氨酰胺 D-Gln(或q)-D-谷氨酰胺His(或H)-组氨酸 D-His(或h)-D-组氨酸Ile(或I)-异亮氨酸 D-Ile(或i)-D-异亮氨酸Leu(或L)-亮氨酸 D-Leu(或l)-D-亮氨酸Lys(或K)-赖氨酸 D-Lys(或k)-D-赖氨酸Phe(或F)-苯丙氨酸 D-Phe(或f)-D-苯丙氨酸Met(或M)-蛋氨酸 D-Met(或m)-D-蛋氨酸Pro(或P)-脯氨酸 D-Pro(或p)-D-脯氨酸Ser(或S)-丝氨酸 D-Ser(或s)-D-丝氨酸Thr(或T)-苏氨酸 D-Thr(或t)-D-苏氨酸Trp(或W)-色氨酸 D-Trp(或w)-D-色氨酸Tyr(或Y)-酪氨酸 D-Tyr(或y)-D-酪氨酸(2)修饰的和异常的氨基酸Aba-α-氨基-正丁酸pClPhe-对氯苯丙氨酸Cha-环己基丙氨酸Chg-环己基甘氨酸Hyp-羟脯氨酸I-Tyr-3-碘代酪氨酸，5-碘代酪氨酸，3，5-二碘代酪氨酸YMeGlu-D-谷氨酸γ甲酯NMePhe-N-甲基苯丙氨酸NMePgl-N-甲基苯基甘氨酸Npa-β-(萘基)丙氨酸3，4-dihydroPro-3，4-二羟脯氨酸PNO2Phe-对硝基苯丙氨酸Nle-正亮氨酸Orn-鸟氨酸Pip-2-哌啶酸酯Pba-对氨基苯基丁酸pSubPhe-对位取代的苯丙氨酸Pgl-苯基甘氨酸Sar-肌氨酸(N-甲基甘氨酸)SubPhe-邻，间，或对，单或双取代的苯丙氨酸Tha-β-(2-噻吩基)丙氨酸Tiq-四氢异喹啉3-羧酸酯(3)氨基和羧基末端酸性取代基Ac-酰基Azt-氮杂环丁烷-2-羧酸酯Cin-肉桂酰3，4-dihydroCin-3，4-二氢肉桂酰Glt-戊二酰Mal-马来酰Oac-8-氨基辛酸Oct-正辛基Suc-琥珀酰Tfa-三氟乙酰＃-C-末端酰胺以下标明了水蛭素已知天然存在的氨基酸序列的变异水蛭素的氨基酸序列的变异12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu CysIle Thr15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly Asn Lys CysLys29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gln Cys Val Thr GlyAsn Lys GlyGln Asp43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56Glu Gly Thr Pro Lys Pro Glx Ser His Asn Asp Gly Asp PheAsn Glu57 58 59 60 61 62 63 64 65Glu Glu ILe Pro Glu Glu Tyr Leu GlnPro Asp Asp Glu(Ala63Tyr64Leu/Asp64Glu65)除甘氨酸外，天然存在的氨基酸都含有手性碳原子。除特别指出者外，本文涉及的光学活性氨基酸都具有L-构型。例如，任何A1或A10组的氨基酸可具有D-或L-构型。按照习惯，本文所书写的肽的结构是使氨基末端位于链的左侧，羧基末端位于链的右侧。烷基和烷氧基的烷基部分应被看作包括直链、支链或环状烷基，例如，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、仲戊基、环戊基、己基、异己基、环己基和环戊基甲基、庚基、辛基(Ot)、8-氨基辛酸(Oac)。具有2～10个碳原子的酰基应被看作包括直链、支链、环状、饱和和不饱和酰基，每个基团上带有1或2个羰基，例如，乙酰(Ac)、氮杂环丁烷-2-羧酸酯(Azt)、苯甲酰琥珀酰、肉桂酰(Cin)、3，4-二氢肉桂酰(3，4-dihydrocin)、马来酰(Mal)、和戊二酰(Glt)。烷基和酰基取代基都被看作包括那些带有卤素取代基的基团，其中卤素基团是氟、氯、溴或碘，例如，三氟乙酰(Tfa)。本文所用的术语“任何氨基酸”不意欲包括任何有氨基取代基的羧酸，而是多肽衍生物领域的技术人员常用的，其包括天然存在的氨基酸以及在制备天然存在肽的合成类似物时肽化学领域的技术人员常用的其它“非蛋白质”α-氨基酸。天然存在的氨基酸都是“L-氨基酸'，有甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、组氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、鸟氨酸、和赖氨酸。作为“任何氨基酸”还应包括天然存在的L-氨基酸的D-异构体(“D-氨基酸”);即D-丙氨酸、D-缬氨酸、D-亮氨酸、D-异亮氨酸、D-丝氨酸、D-蛋氨酸、D-苏氨酸、D-苯丙氨酸、D-酪氨酸、D-色氨酸、D-半胱氨酸、D-脯氨酸、D-组氨酸、D-天冬氨酸、D-天冬酰胺、D-谷氨酸、D-精氨酸。还包括“非蛋白质”α-氨基酸，例如正亮氨酸、正缬氨酸、别异亮氨酸、高精氨酸、硫代脯氨酸、二氢脯氨酸、羟脯氨酸(Hyp)、高丝氨酸、环己基甘氨酸(Chg)、α-氨基-正丁酸(Aba)、环己基丙氨酸(Cha)、氨基苯基丁酸(Pba)、在邻位间位或对位上被(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、卤素或硝基中的一个或两个基团单取代或双取代的或被亚甲二氧基取代的苯丙氨酸，例如对位取代的苯丙氨酸(PSubPhe)和对氯苯丙氨酸，和对硝基苯丙氨酸(PNO2Phe)、β-2-和3-噻吩基-丙氨酸、β-2-和3-呋喃基丙氨酸、β-2-，3-，和4-吡啶基丙氨酸、β-(苯并噻吩-2-和3-基)丙氨酸、β-(1-和2-萘基)丙氨酸(NPa)，丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸的O-烷基化衍生物、谷氨酸和天冬氨酸的甲基酯、S-烷基化半胱氨酸、酪氨酸的O-硫酸酯和卤化酪氨酸，例如3-碘代酪氨酸、5-碘代酪氨酸、3，5-二碘代酪氨酸。关于“水蛭素或其天然变体的序列”，申请人意指见于水蛭素的氨基酸序列性质上适用。术语“该序列的一部分”是指包括衍生于水蛭素或其变体序列的4个氨基酸的连续区域。术语“亲脂性氨基酸”包括Tyr，Phe，Leu，Met，Nle Ile，Val，和Pro。此外，术语“亚氨基酸”是指包括所有N-烷基氨基酸。亚氨基酸的实例为N-甲基苯丙氨酸(NMePhe)、N-甲基苯基甘氨酸(NMePgl)、3，4-二氢脯氨酸(3，4-dihydroPro)、对氨基苯基丁酸(Pba)、肌氨酸(Sar)、和脯氨酸(Pro)、2-哌啶酸酯(Pip)。“含有1-11个任何氨基酸残基的肽”是指反映出氨基酸加到核心氨基酸(A2-A9)的氨基或羧基未端可构成具有其固有活性的核心结构。式1的多肽可与任何无毒的有机酸或无机酸形成药物上可接受的盐。可形成适宜盐的无机酸实例包括盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸及酸性金属盐，例如磷酸氢二钠和硫酸氢钠。可形成适宜盐的有机酸实例包括一元、二元和三元羧酸。例如这类酸有乙酸、乙醇酸、乳酸、三聚氰酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、苹果酸、马来酸、洒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、富马酸、羟基富马酸、苯甲酸、羟苯甲酸、苯基乙酸、肉桂酸、水杨酸、2-苯氧苯甲酸和磺酸如甲磺酸和2-羟基乙磺酸。羧基末端氨基酸部分的盐包括与任何适宜的无机碱或有机碱形成的无毒羧酸盐。作为例证，这些盐包括碱金属盐，例如钠盐和钾盐;碱土金属盐，例如钙盐和镁盐;ⅢA族的轻金属盐，包括铝盐;和有机伯、仲和叔胺，例如，三烷基胺，包括三乙胺、普鲁卡因、二苄胺、1-乙胺、N，N′-二苄基亚乙基二胺、二氢松香胺、N-(低级)烷基哌啶，和任何其它适宜胺的盐。对于化合物的一般基团来说，某些基团是优选的。申请人优选其中各基团定义如下的式1所示的肽衍生物X为氢、乙酰、或琥珀酰;A1为一个键或为包括1-54氨基酸水蛭素或其天然变体序列或其区域;A2为一个键或为Tyr，Trp，Glu，His，Leu，Phe，D-Phe，SubPhe，PclPhe，NMePhe，Tha，3，4-dihydrocin，Cin，Nap，β-(2-和3-噻吩)丙氨酸，β-(2-和3-呋喃基)丙氨酸，β-(2-，3-，和4-吡啶基)丙氨酸，或β-(1-和2-萘基)丙氨酸;A3是一个键，或Glu，Ala;A4是一个键，或Glu，Asp，Pro，Ala，Azt，Pip、亚氨基酸或D-氨基酸;A5是一个键，或Ile，Leu;A6是一个键，或Pro，Sar，D-Ala，Hyp或NMepgl;A7是一个键，或Glu，Gln，Asp或Ala;A8是一个键，或Glu，Asp或Ala;A9是一个键，或Ala，Pro，Cha，或二肽Ala-Tyr，Tyr-Leu，Ala-Phe，Tyr-Tyr，Ala-Leu，Tyr-Ala，Glu-Leu，D-Tyr-Leu，Leu-Phe，Sar-Cha，Pro-Cha，Cha-Leu，Ala-Cha，Tyr-Cha;A10是一个键，或YMeGlu，Glu，D-Glu，Asn，D-Asn，Asn-Ol，Pro，Gln，Ala，Lys，D-Lys，Asp，Orn，Asp，或为Ala;和Y是选自OH，(C1-C8)烷氧基，氨基，单或双(C1-C4)烷基取代的氨基酸的羧基末端残基，或是醇末端残基;其中A3至A9中至少一个位置是一个键。其中各基团定义如下的式1所示的肽衍生物是特别优选的X是Suc，Mal;A1是一个键;A2是Tyr，Phe，Nap;A3是Glu，或是一个键;A4是Glu，Pro，Tiq，或是一个键;A5是Ile，或是一个键;A6是Pro，或是一个键;A7是Glu，或是一个键;A8是Glu，或是一个键;A9是Ala-Cha，Tyr-Leu，Ala，Cha;A10是Gln，D-Glu，Asn;和Y是OH，NH2。其中A3至A8中至少一个位置是一个键。合成本发明的蛋白质可用各种本领域技术人员易于得知的方法来制备。这类方法包括液相肽合成，固相连续和嵌段合成，基因克隆和这些技术的结合。固相连续法可使用所建立的自动化方法采用自动肽合成仪进行。在该程序中，肽在树脂上构建，从C-末端被保护的氨基酸开始。所用的树脂载体可以是任何本领域内常用的适于多肽固相制备的树脂，最好是已与0.5至约3%二乙烯基苯交联的聚苯乙烯，已使之氯甲基化或羟甲基化以为与最初引入的α-氨基被保护的氨基酸形成酯提供位点。对于C-末端酰胺，可使用甲基二苯甲基胺树脂。在在序列的偶联完成之后，除去或适当保留BOC保护基或将其脱除并使N-末端氨基酰化。用适当的氨基醇从树脂上置换出被保护的片段。Bodanszhy等人述及了一例羟甲基树脂〔Chem.Ind.(London)38，1597-98(1966)〕。氯甲基化树脂可购自Bio Rad Laboratories，Richmond，California，Stewart等人在“固相肽合成”第一章第1-6页述及了这种树脂的制备(Freeman & CO，San Francisco 1969)。许多与树脂结合的保护的氨基酸是商业上可得到的。作为一例，为了制备其中羧基末端是D-Glu残基的本发明的多肽，可使用与苄基化，羟甲基化苯乙酰氨基甲基(PAM)树脂结合的叔丁氧羰基(BOC)保护的D-Glu。在α-氨基被保护的氨基酸与树脂载体偶联之后，用任何适宜的方法，例如用溶于二氯甲烷的三氟乙酸，单独用三氟乙酸，或用溶于二噁烷的HCl脱除保护基。去保护可在0℃至室温的某一温度下进行。也可使用其它标准解离试剂和条件脱除特定的α-氨基保护基。在脱除α-氨基保护基之后，按所需顺序将其它氨基被保护的氨基酸逐步偶联。另外，多种氨基酸基团在与载有氨基酸序列的树脂偶联之前可用溶液法偶联。用于引入到多肽序列中的各个氨基酸的α-氨基保护基可以是任何本领域已知的这种保护基。在各类α-氨基保护基中，可考虑(1)酰基型保护基，例如甲酰基、三氟乙酰基、邻苯二甲酰基、甲苯磺酰基、邻硝基苯氧乙酰基和α-氯丁酰;(2)芳族氨基甲酸乙酯型保护基，例如苄氧羰基和取代的苄氧羰基，如对氯苄氧羰基、对硝基苄基羰基、对溴苄氧羰基、对甲氧苄氧羰基、1-(对联苯基)-1-甲基乙氧羰基、α，α-二甲基-3，5-二甲氧苄氧羰基和二苯甲氧羰基;(3)脂族氨基甲酸乙酯保护基，例如叔丁氧羰基(Boc)、二异丙基甲氧羰基、异丙氧羰基、乙氧羰基和烯丙氧羰基;(4)环烷基氨基甲酸乙酯型保护基，例如环戊氧羰基、金刚烷氧羰基和环己氧羰基;(5)硫代氨基甲酸乙酯型保护基，例如苯基硫代羰基;和(6)烷基型保护基，例如三苯甲基和苄基。优选的α-氨基保护基是叔丁氧羰基。如固相肽合成领域所知，许多氨基酸都具有在链制备过程中需要保护的官能度。使用和选择适当的保护基属本领域的技术人员应有的能力，并应取决于欲保护的氨基酸和肽上其它被保护的氨基酸残基的存在。这种侧链保护基的选择是关键的，其中它必须是不会在α-氨基部分保护基解离过程中被解离而除去的基团。例如，适于赖氨酸的侧链保护基是苄氧羰基和取代的苄氧羰基，所述的取代基应选自卤素(例如氯、溴、氟)和硝基(例如，2-氯苄氧羰基、对硝基苄氧羰基、3，4-二氯苄氧羰基)、甲苯磺酰基、叔戊氧羰基、叔丁氧羰基和二异丙氧羰基。苏氨酸和丝氨酸的醇羟基可用乙酰基、苯甲酰基、叔丁基、三苯甲基、苄基、2，6-二氯苄基或苄氧羰基保护。优选的保护基是苄基。选择适当的偶联试剂属于本领域的技能。欲加入的氨基酸是Gln，Asn或Arg的特别适宜的偶联试剂是N，N′-二异丙基碳化二亚胺和1-羟基苯并三唑。这些试剂的使用可防止腈和内酰胺的形成。其它偶联剂是(1)碳化二亚胺(例如，N，N′-二环己基碳化二亚胺和N-乙基-N′-(Y-二甲基氨基丙基碳化二亚胺);(2)氨基腈(例如，N，N-二苄基氨基氰);(3)乙烯酮亚胺;(4)异噁唑鎓盐(例如，N-乙基-5-苯基-异噁唑鎓-3-磺酸盐);(5)环中含有1-4个氮原子的具有芳族特性的单环含氮的杂环酰胺，例如咪唑酰胺、吡唑酰胺、和1，2，4-三唑酰胺。具体适用的杂环酰胺包括N，N′-羰基二咪唑和N，N-羰基-二-1，2，4-三唑;(6)烷氧基化乙炔(例如，乙氧乙炔);(7)可与氨基酸的羧基部分形成混合酐的试剂(例如，氯甲酸乙酯和氯甲酸异丁酯)或欲偶联氨基酸的对称酐(例如，Boc-Ala-O-Ala-Boc);(8)在一个环氮原子上带有羟基的含氮杂环化合物(例如，N-羟基邻苯二甲酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和1-羟基苯并三唑)和(9)Castro氏试剂(BOP)。其它活化试剂及其在肽偶联中的应用详见Kepoor，J.Pharm，SCi，59，PP，1-27(1970)，申请人优先使用对称酐作为除Arg、ASn和Gln之外的所有氨基酸的偶联试剂。将各被保护的氨基酸或氨基酸序列以大约过量4倍的量引入到固相反应器中并在二甲基甲酰胺∶二氯甲烷(1∶1)的介质中或单独在二甲基甲酰胺中或最好单独在二氯甲烷中进行偶联。在未完全偶联的情况下，可在脱除α-氨基保护基之前重复偶联步骤，然后在固相反应器中进行下一个氨基酸的偶联。在合成各阶段偶联反应是否成功由E.Kaise等人所述的茚三酮反应监测(Analyt.Biochem.34，595(1970))。在α-氨基被保护的氨基酸与树脂载体偶联之后，用任何适宜的方法，例如用溶于二氯甲烷的三氟乙酸，单独用三氟乙酸，或用溶于二噁烷的HCl脱除保护基。去保护可在0℃至室温的某一温度下进行。也可使用其它标准解离试剂和条件脱除特定的α-氨基保护基。在脱除α-氨基保护基之后，按所需顺序将其它氨基被保护的氨基酸逐步偶联。另外，多种氨基酸基团在与载有氨基酸序列的树脂偶联之前可用溶液法偶联。在获得所需氨基酸序列之后，从树脂上移出肽并去保护。可通过水解，例如通过在消除剂(例如茴香醚)存在下用无水液态HF处理与树脂结合的多肽完成上述过程。一般在肽链合成完全后脱除保护基，但也可在任何其它适当的时间脱除保护基。去保护肽的纯化和分析可通过多种标准方法完成。适当纯化和分析方法的选择属于本领域的技能。适宜的纯化方法是制备HPLC。纯化肽的分析可通过分析HPLC、氨基酸分析、快原子轰击质谱分析、和任何其它适宜的分析手段来进行。治疗应用本发明的肽衍生物的抗凝血剂量是每天每kg患者体重0.2mg至250mg，取决于待治疗患者血栓形成症状的严重程度和所选的肽衍生物。适于某一患者的剂量可容易地确定。最好每天分1-4剂给药，一般每剂含5mg至100mg活性化合物。在体外介质如贮存的全血中抑制或防止血液凝结所需本发明肽的量可由本领域的技术人员容易地确定。抗凝血疗法可用于治疗和预防各种血栓形成症状，特别是冠状动脉和脑血管疾病。在这一领域有经验的人员都易于掌握需要抗凝血治疗的情况。本文所用的术语“患者”应看作是指哺乳动物如灵长类，包括人、羊、马、牛、猪、狗、猫、大鼠和小鼠。血液凝结的抑制不但适用于患有血栓形成病症个体的抗凝血治疗，而且适用于任何需要抑制血液凝结的时候，例如可防止贮存全血的凝结和防止用于试验或贮存的其它生物样品的凝结。尽管某些肽衍生物在口服并通过肠道后仍然存在，但申请人优选非口服给药，例如皮下、静脉内、肌内或皮内给药。给药方式有储存注射;植入制剂;或例如在含有本发明肽衍生物的喷洒烟雾剂的容器中以喷雾或干粉形式施用于粘膜，如鼻、咽喉和支气管粘膜。对于非肠道使用，化合物可以可注射剂量给药，该化合物可用药理上可接受的稀释剂配成溶液或悬浮液，药物载体可为一种无菌液体如水和油类，加有或不加有表面活性剂和其它可药用试剂。可用于这些制剂的油类实例有石油、动物、植物、或合成来源的油类，例如，花生油，豆油、和矿物油，水，盐水、含水右施糖和相关的糖溶液、乙醇和二醇类如丙二醇或乙二醇是优选的液体载体，特别适用于可注射溶液。化合物可以储存注射或植入制剂形式给药，植入制剂可以使有效成分持续释放的方式配制。可将有效成分压成丸粒或小圆柱体并以储存注射或植入方式径皮下或肌内植入。植入物可使用惰性材料，例如可生物降解的聚合物或合成硅氧烷，例如Silastic，它是Dow-Corning Corg生产的硅氧烷橡胶。实施例本发明可用下列非限制性实例加以说明。实施例1抗凝血肽的制备在Vega半自动肽合成仪上，用8.3mmol的0.56mmol/g Bod D-Glu(Bzl)Merrifield树脂，通过固相法合成肽，用18.3mmol Nα-Boc-氨基酸(Peptides International)进行单对称酐偶联，但对于Boc-Cha，需要两次偶联反应才能作出阴性Kaiser试验。将部分肽树脂(0.7～1.5g)在3～8个周期之后取出并放在一边;对于des-Glu57，在8个周期之后保留1.36g(0.50mmol)Boc-Pro-Ile-Pro-Glu(Bzl)-Glu(Bzl)-Ala-Cha-D-Glu(Bzl)Merrifielcl树脂。将被保护肽片段树脂转移到应用生物系统反应容器中，其中加入与2.0mmol氨基酸进行双对称酐偶联的Boc-Tyr(2-BrZ)，用溶于二氯甲烷的50%三氟乙酸脱除Nα-Boc保护，用溶于二氯甲烷的10%二异丙基乙胺冲洗三次进行中和，用二氯甲烷洗三次，并在氮气流下干燥。经在二甲基甲酰胺中进行双对称酐偶联使肽Nα琥珀酰化，用二甲基甲酰胺冲洗三次，用溶于二氯甲烷的10%二异丙基乙胺洗两次进行中和，用二氯甲烷洗三次并真空干燥。将肽去保护并用含有5%茴香醚的无水HF在0℃解离60分钟。在0℃下真空除去HF;用25%含水乙腈从树脂中取出肽，冷冻并冻干。在0.1%含水三氟乙酸中以29.6-31.6%乙腈线性梯度，以80ml/分的速率，历时15分钟，在C18Beckman50.8×150mm柱上进行制备HPLC。收集并冻干主峰(在280nm处监测)，得到281mg所需产物。用HPLC测定均匀性Vydac 218 TP54(4.6×250mm)C18柱，2.0ml/分，t0＝1.5分，以15-40%乙腈线性梯度经25分钟洗脱至0.1%三氟乙酸的时间是17.1分钟。纯化的标记肽的分析给出了所需的分子离子峰(FAB-MS)并根据所需肽进行了氨基酸分析。用这种方法，下列肽具有如下所示的固定的物理特性。在凝血酶诱导的血纤维蛋白凝血块抑制测定中试验了样品。所有测定溶液都是用含有0.12M氯化钠，0.01M磷酸钠，0.01%叠氮化钠和0.1%牛血清白蛋白的测定缓冲液(pH7.4)配制的。将牛凝血酶滴定至适当的浓度以便能够通过微滴板读数器(Bio-Tek EL309)在405nm处60分钟内监测血纤维蛋白凝块的形成。将这种凝血酶溶液(50μl;0.2Pmol)加到含有50μl待试合成肽溶液的微滴板孔中。搅拌1分钟并在20℃再保温10分钟后，加入100μl于0.1%EDTA中的稀血浆(1∶10)并涡旋20秒钟。用自动读数器，以5分钟的间隔监测溶液的浊度。根据结果计算IC50，IC50被定义为相对于不含抑制剂的对照可导致观察到的混浊度之半的肽浓度。这相当于血纤维蛋白凝块形成时间增加两倍。对于用人凝血酶进行的测定来说，在30分钟内将人和牛凝血酶以同样速率滴定到可产生血纤维蛋白凝块的浓度。这样，下列肽具有固定的生物学特性，在下示实例中，+表示IC50＞25μM和＜200μM，++表示IC50＜25μM。1)Suc-Tyr-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu OHMW 1200 FAB-MS(MH)+1201Z(3) Pro(2) Ile(1) Tyr(1) Ala(1)3.08 1.97 0.96 0.99 0.99体外效价+2)H-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln-OHMW 1370 FAB-MS(MH)+1371Z(5) Ile(1) Tyr(1) Gly(1) B(1) Phe(1) Leu(1)4.93 0.85 0.95 1.09 1.10 1.08 0.99体外效价+3)Suc-Tyr-Glu-Pro-Tiq-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OHMW 1278 FAB-MS(MH)+1279Z(4) Pro(1) Ile(1) Tyr(1) Ala(1) Cha(1)4.05 0.93 0.96 0.95 1.03 1.03体外效价++4)Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Gln-NH2MW 1158 FAB-MS(MH)+1175Z(4) Pro(2) Ile(1) Tyr(1) Ala(1)4.15 1.94 0.96 1.01 0.95体外效价++5)Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Cha-Gln-NH2MW 1256 FAB-MS(MH)+1257Z(4) Pro(2) Ile(1) Tyr(1) Ala(1)4.15 1.98 0.91 0.97 1.05体外效价++6)Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Ala-Cha-Asn-OHMW 1184 FAB-MS(MH)+1185B(1) Z(2) Pro(2) Ile(1) Tyr(1) Ala(1)1.02 2.09 1.98 0.93 1.01 0.97体外效价++7)Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Asn-OHMW 1161 FAB-MS(MH)+1162Z(3) Pro(2) Ile(1) Tyr(1) Ala(1) B(1)3.14 1.95 0.95 1.00 0.96 1.01体外效价++8)Mal-Tyr-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OHMW 1198 FAB-MS(MH)+1198Z(3) Pro(2) Ile(1) Tyr(1) Ala(1)3.06 2.01 0.95 0.99 1.01体外效价+9)Suc-Nap-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OHMW 1234 FAB-MS(MH)+1234Z(3) Pro(2) Ile(1) Ala(1)3.08 2.00 0.94 0.97体外效价++10)Suc-Tyr-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OHMW 1232 FAB-MS(MH)+1233Z(4) Pro(1) Ile(1) Tyr(1) Ala(1)4.07 0.99 0.96 0.98 0.99体外效价+11)Suc-Tyr-Glu-Pro-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OHMW 1216 FAB-MS(MH)+1217Z(4) Pro(2) Tyr(1) Ala(1)4.05 1.97 0.98 1.00体外效价+12)Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OHMW 1232 FAB-MS(MH)+1233Z(4) Pro(1) Ile(1) Tyr(1) Ala(1)4.10 1.01 0.94 0.96 0.99体外效价++13)Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OHMW 1200 FAB-MS(MH)+1201Z(3) Pro(2) Ile(1) Tyr(1) Ala(1)3.16 1.97 0.93 0.96 0.98体外效价++14)Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-D-Glu-OHMW 1176 FAB-MS(MH)+1177Z(4) Pro(2) Ile(1) Tyr(1) Ala(1)4.08 1.97 0.96 0.99 1.00体外效价++15)Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Cha-D-Glu-OHMW 1258 FAB-MS(MH)+1259Z(4) Pro(2) Ile(1) Tyr(1)4.10 2.01 0.91 0.98体外效价++16)Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Gln-OHMW 1175 FAB-MS(MH)+1175Z(4) Pro(2) Ile(1) Tyr(1) Ala(1)4.11 1.98 0.93 1.01 0.97体外效价++17)Suc-Phe-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Gln-NH2MW 1158 FAB-MS(MH)+1159Z(4) Pro(2) Ile(1) Ala(1) Phe(1)4.10 2.05 0.93 0.96 0.97体外效价+18)Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-OHMW 1200 FAB-MS(MH)+1201Glx(3) Pro(2) Ile(1) Tyr(1) Ala(1)3.10 1.94 0.98 0.99 0.99体外效价++19)Suc-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OHMW 1166 FAB-MS(MH)+1167Glx(4) Pro(2) Ile(1) Ala(1)4.12 1.95 0.96 0.98体外效价+权利要求1.下式的肽衍生物及其可作药用的盐的制备方法X-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-Y其中X是氨基末端残基，选自氢、1或2个具有1-10个碳原子的烷基、1或2个具有2-10个碳原子的酰基、苄氧羰基或叔丁氧羰基；A1是水蛭素或其天然变体的序列或该序列的一部分、一个键、或是含有1-11个任何氨基酸残基的肽；A2是一个键或是Phe，Subphe，Pclphe，D-phe，NMephe，pgl，Tha，His，Cin，Nap，Leu，Gln，3，4-dihydroCin，β-(2-和3-噻吩基)丙氨酸，β-(2-和3-呋喃基)丙氨酸，β-(2-，3-，和4-吡啶基)丙氨酸，β-(苯并噻吩-2-和-3-基)丙氨酸，β-(1-和2-苯基)丙氨酸，TYr或Trp；A3是一个键，或是Glu，Asp，或Ala；A4是一个键，或是任何氨基酸；A5是一个键，或是Ile，Val，Leu，Nle，Phe，Ala，或D-Leu；A6是一个键，或是Pro，Hyp，3，4-dihydropro，噻唑烷-4-羧酸酯，Sar，NMepgl，Azt，Pip，Ala或D-Ala；A7是一个键，或是任何氨基酸；A8是一个键，或是任何氨基酸；A9是一个键，或是Tyr，I-Tyr，D-Tyr，His，Ala，Met，Trp，Phe，Leu，Nle，Ile，Val，Cha和Pro或是至少含有这些氨基酸或亲脂性氨基酸之一的二肽；A10是水蛭素或其天然变体的序列或该序列的一部分，一个键，或是含有1-11个任何氨基酸残基的肽；Y是羧基末端残基，选自OH，(C1-C8)烷氧基、氨基、单或双(C1-C4)烷基取代的氨基酸，或是醇末端残基；其中A3至A9中至少一个位置是一个键；该方法包括以下步骤a)使用一个适当结合有其C-末端被保护的A10组氨基酸的树脂；b)依次偶联A9至A1组α-氨基被保护的氨基酸，以达到被保护的所要求的氨基酸序列；c)除去所说保护基并纯化所需肽。2.权利要求1的肽衍生物的制备方法，其中A2是Tyr，Nap，phe。3.权利要求1的肽衍生物的制备方法，其中A3是一个键，或Glu。4.权利要求1的肽衍生物的制备方法，其中A4是一个键，pro，Tiq，亚氨基酸，或D-氨基酸。5.权利要求1的肽衍生物的制备方法，其中A5是一个键，Ile。6.权利要求1的肽衍生物的制备方法，其中A6是一个键，pro。7.权利要求1的肽衍生物的制备方法，其中A7是一个键，Glu或Ala。8.权利要求1的肽衍生物的制备方法，其中A8是一个键，Glu或Asp。9.权利要求1的肽衍生物的制备方法，其中A9是Ala，Cha，Ala-Cha，Tyr-Leu。10.权利要求1的肽衍生物的制备方法，其中A10是Gln，Asn，或D-Glu。11.权利要求1的肽衍生物的制备方法，其中X是H，或NH2。12.一种减少需治疗患者中血液凝结的方法，该方法包括施用有效抗凝血量的权利要求1-11之一的肽衍生物和药物上可接受的载体。13.一种减少某一介质中血液凝结的方法，该方法包括使该介质与抗凝血有效量的权利要求1-11之一的肽接触。14.一种为权利要求1-11的天然存在的水蛭素类似物的肽，其含有负责与凝血酶结合的结合位点，因此能作为凝血酶的竞争性抑制剂。全文摘要本发明涉及作为有用的抗凝血剂的肽衍生物。文档编号C07K14/815GK1050720SQ90108049公开日1991年4月17日 申请日期1990年9月30日 优先权日1989年10月3日发明者约翰·L·卡斯特南凯 申请人:默里尔多药物公司