一种抗凝血因子X激活酶的单克隆抗体及其应用的制作方法

本发明属于生物医药，具体涉及一种抗凝血因子x激活酶的单克隆抗体及其应用。

背景技术：

1、人类的凝血机制是一个非常复杂而精细的过程，凝血因子x是凝血系统中非常关键的成分之一。凝血因子x(coagulation factor x，fx)是一种维生素k依赖的丝氨酸蛋白酶原，其活性形式(fxa)为体内凝血酶原(prothrombin)唯一的生理性激活物，在共同凝血途径中起着关键作用。凝血因子x激活酶(fx激活酶)可以特异性地激活fx，使活性部位充分的暴露生成fxa，fxa进而与损伤部位激活的血小板、fva以及钙离子形成凝血酶原复合物，从而增加凝血酶生成，凝血酶激活损伤部位的血小板和v、ⅷ并通过纤维蛋白原向纤维蛋白的转换形成止血栓，达到出血患者止血的目的。在外科创面出血、内科出血性疾病、凝血系统疾病，例如血友病等方面都有潜在的巨大应用价值。最早发现也是迄今为止活性最高的fx激活酶是从圆斑蝰蛇(vipera russelli，daboia russellii siamensis)的毒液中提取发现的，简称rvv-x。

2、但无论是蛇液的粗毒，或是包含凝血因子x激活酶的成品止血药物，由于凝血因子x激活酶在其中的含量较低，现有的lowry法和bca法均难以检测到，因此，建立一个灵敏度更高的方法是必要的。

技术实现思路

1、本发明提供了一种分离的抗凝血因子x激活酶的单克隆抗体，能够特异性结合抗凝血因子x激活酶(例如，rvv-x)。本发明还提供了一种使用该单克隆抗体的方法，即将该抗体作为包被抗体应用于凝血因子x激活酶(例如，rvv-x)含量的检测方法中，可更准确检测凝血因子x激活酶(例如，rvv-x)的含量。

2、本发明第一个目的是提供一种分离的抗凝血因子x激活酶单克隆抗体，所述抗体包含vh，所述vh包含：hc-cdr1，其包含氨基酸序列seq id no:1，hc-cdr2，其包含氨基酸序列seq id no:2，和hc-cdr3，其包含氨基酸序列seq id no:3；以及vl，所述vl包含：lc-cdr1，其包含氨基酸序列seq id no:4，lc-cdr2，其包含氨基酸序列seq id no:5，和lc-cdr3，其包含氨基酸序列seq id no:6。

3、在本发明的一个具体实施方式中，所述抗体包含：vh，其包含氨基酸序列seq idno:7，以及vl，其包含氨基酸序列seq id no:8。

4、在一些实施方式中，所述分离的抗凝血因子x激活酶单克隆抗体进一步包含fc片段。在一些实施方式中，所述分离的抗凝血因子x激活酶单克隆抗体是全长的igg抗体。在一些实施方式中，所述分离的抗凝血因子x激活酶单克隆抗体是全长的igg1、igg2、igg3或igg4抗体。在一些实施方式中，所述分离的抗凝血因子x激活酶单克隆抗体是嵌合的、鼠源的、全人的或人源化的抗体。在一些实施方式中，所述分离的抗凝血因子x激活酶单克隆抗体是抗原结合片段，所述抗原结合片段选自fab、fab’、f(ab)’2、fab’-sh、单链fv(scfv)、fv片段、dab、fd、纳米抗体(nanobody)、双链抗体(diabody)和线性抗体。

5、在本发明的一个具体实施方式中，所述抗体还进一步包含重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区包含氨基酸序列seq id no:9，所述轻链恒定区包含氨基酸序列seq idno:10。

6、本发明的第二个目的是提供一种检测样品中凝血因子x激活酶含量的方法，所述方法采用上述的抗凝血因子x激活酶的单克隆抗体。

7、在本发明的一个具体实施方式中，所述方法为双抗夹心酶联免疫检测法。

8、在本发明的一个优选实施方式中，本发明中所述的抗凝血因子x激活酶的单克隆抗体作为包被抗体；在本发明的一些实施例方式中，所述包被抗体的浓度为1.6-2.4μg/ml，优选为1.6、1.8、2.0、2.2或2.4μg/ml。

9、在本发明的一个具体实施方式中，所述方法包含如下步骤：

10、(1)用本发明所述的抗凝血因子x激活酶的单克隆抗体包被酶标板；

11、(2)加入待测样品进行孵育，之后弃去孔内液体并清洗；

12、(3)加入一抗进行孵育，之后弃去孔内液体并清洗；

13、(4)加入标记的二抗进行孵育，之后弃去孔内液体并清洗；

14、(5)进行显色反应，反应完成后加入终止液，读取吸光度值；

15、(6)根据吸光度值计算待测样品中凝血因子x激活酶的含量。

16、在本发明的一个具体实施方式中，所述一抗是纯化的兔抗凝血因子x激活酶的多克隆抗体；在本发明的一些实施方式中，所述一抗的浓度为0.8-1.2μg/ml，优选为0.8、0.9、1.0、1.1或1.2μg/ml。

17、在本发明的一个具体实施方式中，所述纯化的兔抗凝血因子x激活酶的多克隆抗体是通过如下制备方法获得：首次免疫时，采用抗原多点免疫，向兔注射凝血因子x激活酶；首次免疫后再次用凝血因子x激活酶进行3-5次加强免疫，最后一次加强免疫结束后取血清，经纯化后获得纯化的兔抗凝血因子x激活酶的多克隆抗体。

18、在本发明的一个具体实施方式中，所述标记的二抗是山羊抗兔抗体或马抗兔抗体；在本发明的一个优选实施方式中，所述二抗由辣根过氧化物酶(hrp)标记。

19、在本发明的一个具体实施方式中，所述方法采用双波长检测法，优选地，参比波长为630nm，检测波长为450nm。

20、在本发明的一个具体实施方式中，所述待测样品中凝血因子x激活酶的含量是根据标准曲线计算获得，所述标准曲线是利用凝血因子x激活酶标准品绘制得到的。

21、在本发明的一个具体实施方式中，所述凝血因子x激活酶标准品的浓度梯度范围为62.5pg/ml-2000pg/ml。

22、本发明的第三个目的是提供一种用于检测样品中凝血因子x激活酶含量的双抗夹心酶联免疫检测试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的单克隆抗体。

23、在本发明的一个优选实施方式中，本发明所述的单克隆抗体作为包被抗体。

24、在本发明的一个具体实施方式中，所述试剂盒还包括一抗、二抗和凝血因子x激活酶标准品。

25、在本发明的一个具体实施方式中，所述一抗是纯化的兔抗凝血因子x激活酶的多克隆抗体。

26、在本发明的一个具体实施方式中，所述纯化的兔抗凝血因子x激活酶的多克隆抗体是通过如下制备方法获得：首次免疫时，采用抗原多点免疫，向兔注射凝血因子x激活酶；首次免疫后再次用凝血因子x激活酶进行3-5次加强免疫，最后一次加强免疫结束后取血清，经纯化后获得兔抗凝血因子x激活酶的多克隆抗体。

27、在本发明的一个具体实施方式中，所述二抗是山羊抗兔抗体或马抗兔抗体；在本发明的一个优选实施方式中，所述二抗由辣根过氧化物酶(hrp)标记。

28、在本发明的一个具体实施方式中，所述凝血因子x激活酶标准品的浓度梯度范围为62.5pg/ml-2000pg/ml。

29、在本发明的一些实施方式中，所述凝血因子x激活酶来源于圆斑蝰蛇(daboiarusselii siamensis)。在本发明的一些优选实施方式中，所述凝血因子x激活酶是rvv-x；进一步优选地，所述凝血因子x激活酶是从圆斑蝰蛇的蛇毒中提取获得，或者是通过基因工程的方法获得。

30、本发明所述的“抗体”包括全长抗体及其抗原结合片段。全长抗体包括两条重链和两条轻链。轻链和重链的可变区负责抗原的结合。两条链中的可变区通常包括3个高变的环，被称为互补决定区(cdrs)(轻链(lc)cdrs包括lc-cdr1、lc-cdr2和lc-cdr3，重链(hc)cdrs包括hc-cdr1、hc-cdr2和hc-cdr3)。本文所披露的抗体或抗原结合片段的cdr边界可以通过kabat，chothia或al-lazikani惯例来定义或识别(al-lazikani 1997；chothia1985；chothia 1987；chothia 1989；kabat 1987；kabat 1991)。重链或轻链的3个cdr区插入到被称为框架区(frs)的侧翼区段之间，所述框架区比cdr区具有更高的保守性，并形成支撑高变环的支架。重链和轻链的恒定区并不参与抗原结合，但展示出多种效应功能。抗体是基于它们重链恒定区的氨基酸序列进行分类的。本发明所述的全长抗体可以是iga、igd、ige、igg和igm等同种型，其特征在于分别具有α、δ、ε、γ和μ型重链。进一步的，本发明中所述的几种主要的抗体类别可进一步被分为亚类，包括：igg1(γ1重链)、igg2(γ2重链)、igg3(γ3重链)、igg4(γ4重链)、iga1(α1重链)或iga2(α2重链)。

31、如本发明所述，术语“抗原结合片段”包括抗体片段，例如，双链抗体、fab、fab’、f(ab’)2、fv片段、二硫键稳定的fv片段(dsfv)、(dsfv)2、双特异性dsfv(dsfv-dsfv’)、二硫键稳定的双链抗体(ds双链抗体)、单链抗体(scfv)、scfv二聚体(二价双链抗体)，由包含一个或多个cdrs的抗体片段组成的多特异性抗体、单域抗体、纳米抗体、域抗体、二价域抗体或者能够与抗原结合但不包含完整抗体结构的任何其他抗体片段。

32、本发明提供的上述技术方案具有以下优异效果：

33、1、本发明中的抗凝血因子x激活酶(更具体的，rvv-x)单克隆抗体可特异性结合凝血因子x激活酶(更具体的，rvv-x)，能够用于特异性检测样品中凝血因子x激活酶(更具体的，rvv-x)的含量。

34、2、本发明的方法中采用所述的单克隆抗体对凝血因子x激活酶(更具体的，rvv-x)进行检测，具有专属性高、准确性高、重复性良好、精密度良好、定量限低、耐用性好等优势。

35、3、本发明的方法适用范围广，不仅可用于检测蛇毒液中的凝血因子x激活酶(更具体的，rvv-x)含量，也可用于检测蛇毒液经工艺纯化获得的原液、以及凝血药物成品制剂等产品。