抗感两种魔芋材料不同Pcc侵染阶段基因表达谱构建方法

本发明属于基因表达谱构建，尤其涉及一种抗感两种魔芋材料不同pcc侵染阶段基因表达谱构建方法。

背景技术：

1、目前，由胡萝卜软腐果胶杆菌pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum(pcc)侵染引起的魔芋软腐病，是制约我国魔芋产业规模发展的主要因素之一。植物与病原物的互作研究是病害防治的基础，目前，魔芋对pcc侵染的响应机制尚不明确。

2、魔芋(amorphophallus spp.)是天南星科多年生草本植物，。魔芋葡甘聚糖(kgm)是从魔芋球茎中提取的一种水溶性多糖(膳食纤维)，在食品科学和营养学、生物技术、医药工业和精细化工等领域有着广泛的应用(behera and ray,2016；zhu,2018)。然而，由p.carotovorum subsp.carotovorum(pcc)引起的细菌性软腐病是一种严重危害魔芋生产的广布性、灾难性病害。pcc侵染可魔芋植株的所有部分(叶片、叶柄以及块茎)，通常产生叶片黄化和萎蔫、叶柄内部组织及地下球茎软腐的症状，随后全株死亡腐烂。田间平均发病率35％以上，可造成魔芋减产达30～70％，甚至大面积绝收。此外，在魔芋贮藏期间也可发病造成块茎发病腐烂，给农民造成非常巨大的经济损失(wei et al.,2022；吴旭等,2018)。

3、近年来，转录组研究方法已从基本的dna微阵列平台发展到了rna-seq技术。rna-seq技术是将转录组测序建库的实验方法和数字基因表达谱的信息分析手段结合起来的研究方法，具有测序成本低，高通量、高灵敏度、高精确度、重复性好，能对基因组的功能进行注释以及不受物种限制等优点，是分子生物学、生物技术和生物信息学中流行的测序方法(tyagi et al.,2022)。目前已广泛应用于农作物性状、植物生理调控和抗病机制等领域(范鹏敏,2021)。在植物研究中，转录组学和基因组学之间存在着一些显著的差异。首先，与转录组学(rna-seq)相比，基因组组装在植物研究中更加复杂和昂贵；在没有参考基因组的情况下，转录组可以用来评估生物或植物的整体转录活性。其次，转录组随着时间和空间的变化而变化，因为它包括次生代谢途径的信息以及不同时间和空间区域基因表达的变化。据研究，生物活性化合物在不同植物组织中的积累取决于该组织的基因表达水平和它们产生的时间。这是因为植物有不同的生长条件和时期，即使在同一物种内也是如此。因此，转录组在识别与治疗性植物成分相关的基因方面优于基因组(wang et al.,2009)。这些差异对于植物功能基因组的挖掘、基因调控域的发育、遗传多样性(显性和隐性基因)以及生物活性物质的研究具有重要意义(tyagi and ranjan,2021；tyagi et al.,2022)。

4、通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：植物与病原物的互作研究是病害防治的基础，目前，魔芋对pcc侵染的响应机制尚不明确。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种抗感两种魔芋材料不同pcc侵染阶段基因表达谱构建方法。

2、本发明是这样实现的，一种抗感两种魔芋材料不同pcc侵染阶段基因表达谱构建方法，所述抗感两种魔芋材料不同pcc侵染阶段基因表达谱构建方法，包括以下步骤：

3、第一步，pcc接种魔芋与样本采集，选择在温室生长5个月后的生长状态良好且完全健康的a.konjac和a.muelleri植株，将100μl的pcc菌液1×108cfu/ml接种于叶柄基部1-2cm处，同时接种等量的无菌水作为对照；

4、第二步，魔芋总rna的提取、cdna文库构建与质检测序，参照reagent试剂盒步骤提取魔芋根和叶柄组织中的总rna，用nanodrop2000对所提的rna的纯度和浓度进行检测，用琼脂糖凝胶电泳检测rna的质量，用agilent5300生物分析仪检测rna的完整性，提取出的rna一部分用于转录组测序；

5、第三步，进行测序数据质控与参考序列比对分析、基因表达量分析和样本关系分析、差异表达基因筛选与富集分析和加权共表达网络分析。

6、进一步，所述第一步，具体包括：处理后，根据pcc侵染魔芋植株的症状，确定每个种质分3个阶段取样，即接种前0h，接种48h，接种96h各取样一次；每个处理设置3次重复，每个重复包含3株魔芋；

7、样本采集：在每个取样阶段将供试魔芋植株整株拔起，用蒸馏水洗净根部后，对供试魔芋的根、叶柄和叶片三个部位进行取样，将每个重复的3株魔芋样本混合后作为一个样品，经液氮速冻后，置于-80℃冰箱保存，用于后续转录组的测定。

8、进一步，所述第二步，具体包括：rna样品检测合格后，利用带有oligo(dt)的磁珠与ploya进行a-t碱基配对，从总rna中分离出mrna；随后在样品中加入fragmentationbuffer将mrna进行随机性打断；在逆转录酶的作用下，加入六碱基随机引物，以mrna为模板反转合成用于构建转录组文库的cdna链，通过纯化、末端修复及及加a尾连接测序接头后，筛选出适宜长度的cdna片段pcr扩增后得到最终文库；通过tbs380定量后，用illuminahiseqtm2500进行测序。

9、进一步，所述第三步测序数据质控与参考序列比对分析，具体包括：

10、(1)原始测序数据质控，对原始测序数据进行过滤，得到高质量的测序数据cleandata，具体步骤及顺序如下：

11、去除reads中的接头序列，去除由于接头自连等原因导致没有插入片段的reads；

12、将序列末端(3’端)低质量的碱基修剪掉，如剩余序列中仍然有质量值小于10则将整条序列剔除，否则保留；

13、去除含n比率超过10％的reads；

14、舍弃去adapter及质量修剪后长度小于20bp的序列；

15、(2)与参考基因组序列比对

16、将质控后的原始数据，即clean data(reads)，与魔芋参考基因组比对，获得用于后续转录本组装、表达量计算等的mapped data(reads)，将保留下来的mapped data(reads)使用hisat2软件进行序列比对分析，同时对该次转录组测序的比对结果进行质量评估，包括测序饱和度、基因覆盖度、reads在参考基因组不同区域分布以及reads在不同染色体分布分析；并将比对后的情况进行统计，包括能定位到基因组上的clean reads的数量total mapped、在参考序列上有多个比对位置的clean reads的数量multiple mapped、在参考序列上有唯一比对位置的clean reads的数量unique mapped。

17、进一步，所述第三步基因表达量分析和样本关系分析，具体包括：

18、(1)基因表达量分析

19、参考序列比对分析之后，通过定位到基因组区域的序列clean reads的数量readscounts计算基因的表达水平。使用软件rsem分别对基因和转录本的表达水平进行定量分析，以便后续分析不同样本间基因/转录本的差异表达情况，定量指标为fpkm，计算得到的基因表达量可直接用于比较不同基因间表达差异，具体的计算公式如下：

20、

21、其中，x为唯一比对到基因的fragments数，l为基因的长度，n为唯一比对到参考基因的总fragments数。

22、进一步，所述第三步样本关系分析，具体包括：

23、基于表达矩阵，进行样本间venn，相关性和pca分析，其中样本间venn分析可以获得样本间或组间的共表达和特表达基因/转录本；相关性分析有助于理解样本间特别是生物学重复间的相关性，验证实验设计的合理性；pca分析基于表达量对样本聚类，识别影响样本类群较大的样本；皮尔逊相关系数被用作生物学重复的评估指标。

24、进一步，所述第三步的差异表达基因筛选与富集分析，具体包括：

25、(1)差异表达基因筛选

26、使用deseq2软件对基因表达差异进行分析，显著差异表达基因的默认筛选标准为：fdr<0.05&|log2fc|≧1，当一个基因同时满足这两个条件时，则视该基因为差异表达基因deg；

27、(2)差异基因go富集分析

28、go是基因本体论联合会建立的将全世界所有与基因有关的研究结果进行分类汇总的综合数据库，数据库标准化不同数据库中的关于基因和基因产物的生物学术语，对基因和蛋白功能进行限定和描述；利用go数据库，可以将基因按照它们参与的生物学过程bp、构成细胞的组分cc和实现的分子功能mf进行分类；对差异基因进行go功能显著性富集分析，在基因功能水平阐明样本间的差异，使用软件goatools进行go富集分析，从而获得差异基因集中的基因主要具有哪些go功能；使用方法为fisher精确检验，当经过校正的p值(padjust)＜0.05时，认为go功能存在显著富集情况。

29、进一步，所述第三步差异基因kegg富集分析，具体包括：

30、kegg数据库是基因组破译方面的公共数据库，通过pathway显著性富集能确定差异表达基因参与的最主要的生化代谢途径和信号转导途径，使用koba进行kegg pathway富集分析，使用fisher精确检验进行计算，为控制计算假阳性率，采用bh方法进行多重检验，经过校正的p值以0.05为阈值，满足此条件的kegg通路定义为在差异表达基因中显著富集的kegg通路。

31、进一步，所述第三步加权共表达网络分析，具体包括：采样wgcna算法构建基因共表达网络，计算参试样本与各模块之间的相关性，探索基因网络与表型之间的关联关系，筛选出与魔芋响应pcc胁迫相关的模块，对模块中的基因进行kegg代谢途径富集和基因聚类分析，以确定魔芋在响应胁迫过程中发挥作用的关键基因hub gene。

32、进一步，所述抗感两种魔芋材料不同pcc侵染阶段基因表达谱构建方法的外源茉莉酸甲酯处理对魔芋抗pcc侵染的影响，取10个两年生、长势基本一致的健康花魔芋球茎，清洗干净后用浓度为200μm的茉莉酸甲酯浸泡24h，同时以无菌水处理作为对照，于处理后将花魔芋球茎切成约1cm厚的切片，将20μl的pcc菌液接种于切片的中央，28℃恒温培养箱培养48h后观察发病状况并记录，建立0～5级共6个级别；

33、0级：无明显发病症状；

34、1级：病斑直径<10mm；

35、2级：10mm≤病斑直径<20mm；

36、3级：20mm≤病斑直径<30mm；

37、4级：30mm≤病斑直径<40mm；

38、5级：病斑直径≥40mm。

39、病情指数＝[∑(各级感染数×相应级数)]/(调查总数×最高级数)×100％；

40、实时荧光定量pcr，对rna-seq分析显示有表达水平差异的15个候选基因利用qrt-pcr进行表达分析，以魔芋actin基因作为内参基因，根据基因序列信息，利用primer 6.0软件设计pcr引物，qrt-pcr在bio-rad cfx connect real-time system检测系统上进行，qpcr体系为：green supermix 5μl，前后引物各0.5μl，模板dna 1μl，加水补足至10μl。程序为：95℃ 3min，95℃ 10s，60℃ 30s，39个循环；65℃温度以每4秒升高1℃的方式升温至95℃计算熔解曲线，通过熔解曲线的单峰性验证扩增产物的特异性，采用实时定量pcr和2–δδct法差异基因的转录本表达进行定量。

41、结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：

42、第一本发明利用rna-seq测序平台构建了抗感两种魔芋材料不同pcc侵染阶段的基因表达谱，通过与相对应的样品对照基因表达谱进行比较，a.konjac和a.muelleri叶柄内分别有23799个和17125个基因表达水平在pcc侵染后发生显著变化，ak_pc48s比较组有3834个差异表达基因(1987个上调，1847个下调)，am_pc48s比较组有4601个差异表达基因(2179个上调，2422个下调)。通过对差异基因的go和kegg富集分析，发现两种魔芋材料在转录水平对pcc侵染的响应差异主要体现在植物激素信号转导、植物-病原菌互作(抗病相关基因等)以及抗病物质代谢等方面；对相关差异表达基因进行了整理发现茉莉酸(ja)和乙烯(eth)信号途径、mapk信号转导、病程相关蛋白如pr1等可能是两种魔芋分子抗病机制的重要组成部分；利用wgcna分析筛选到a.konjac和a.muelleri防御相关的41个和25个hub基因，其中mapk4、myc2、rte1等hub基因在两种魔芋受侵染后均被诱导显著上调表达。进一步利用qrt-pcr对15个候选基因进行表达分析，结果显示rna-seq和qrt-pcr两种方法所得结果较为一致，尤其是表达变化趋势高度一致。

43、第二，本发明中，mapk信号通路、植物激素信号转导通路中一些关键基因(如mapk4、rte1、ein3等)的表达水平在侵染前(对照)、侵染48h和96h均表现为抗性a.muelleri高于敏感a.konjac，由此表明mapk信号转导在a.muelleri免疫反应的激活方面具有重要作用。此外，ja信号通路也同时参与了两种魔芋对软腐病的防御反应，外源meja预处理试验证实，其可以减轻魔芋球茎软腐病的发病程度，meja预处理的病情指数较对照降低约13.75％。

44、第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：

45、(1)本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：

46、本发明利用rna-seq测序平台构建了抗病和感病两种魔芋材料不同pcc侵染阶段的基因表达谱，筛选了抗病和感病魔芋的重要抗性相关基因，可以为魔芋软腐病抗性相关基因的挖掘和调控提供有益参考，有利于软腐病的防治研究，同时为培育魔芋抗软腐病新种质奠定前期基础。

47、(2)本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：

48、转录组学技术(rna-seq)是筛选抗逆基因以及揭示植物抗逆分子机制的重要技术。本发明提出了一种抗感两种魔芋材料不同pcc侵染阶段基因表达谱构建方法。根据我们提出的方法，揭示了魔芋抗pcc侵染的重要代谢途径，同时筛选了魔芋软腐病防御相关的抗性基因，在此基础上，进一步比较抗病和感病魔芋之间关键抗性基因的表达模式差异，有利于探明抗病种质软腐病防御相关的hub基因，从而解析抗性魔芋与软腐病菌的互作机制，以及造成两种魔芋抗性差异的潜在原因。