特异性识别ANO1的核酸适体及其应用

本公开涉及特异性识别ano1的核酸适体及其应用，具体地，涉及特异性识别ano1的核酸适体及其衍生物、组合物、其筛选方法及其用途。

背景技术：

1、核酸适体(aptamer)是通过指数富集配基的系统进化技术(selex)筛选得到的，能特异结合靶物质的单链寡聚核苷酸，其可以与其他靶标如蛋白质、金属离子、小分子、多肽甚至整个细胞进行特异性的结合，其具有高亲和力，因此在生化分析，环境监测，基础医学，新药合成等方面展示广阔的前景。

2、核酸适体与抗体功能类似，但是与抗体相比具有更多的优势，具有更高的亲和力与特异性；无免疫原性；能够化学合成，成本低；可进行标记；稳定性好，易于保存等优点。核酸适体的靶分子更为广泛，包括金属离子、氨基酸、核酸、多肽、蛋白质，并从单一靶标扩展至完整的病毒颗粒及细胞等复合物靶标。

3、另一方面，钙激活氯通道蛋白1(anoctamin 1，ano1)，也称为tmem16a，是一个钙激活的氯通道蛋白。它是ano(anoctamin)家族的一员，该家族包括多种钙激活的氯通道和磷脂酰酸酯酶。ano1钙激活的氯通道具有多种重要的生理功能，如上皮细胞分泌液体和cl-、平滑肌细胞收缩、控制间质起搏器活动、维持内皮细胞的生理功能、背根节细胞的伤害性感觉[1]。近些年研究发现：ano1在多种恶性肿瘤中高表达，包括结直肠癌[2]、头颈部鳞状细胞癌(hnscc)[3]、乳腺癌和胃肠间质瘤[4]、前列腺癌[5]等，其高表达可能与预后不良以及转移相关[6]。而ano1在正常组织中表达有限，能够有效降低潜在的治疗毒性，因而ano1也被认为是一种潜在的肿瘤治疗靶点。

4、因此，仍然需要开发一种可以特异性识别ano1蛋白的核酸适体，以用于ano1阳性肿瘤的诊断及靶向治疗。

5、现有技术文献：

6、dulin n o.calcium-activated chloride channel ano1/tmem16a:regulationof expression and signaling[j].front physiol,2020,11:590262.doi:10.3389/fphys.2020.590262.

7、liu z,zhang s,hou f,et al.inhibition of ca(2+)-activated chloridechannel ano1 suppresses ovarian cancer through inactivating pi3k/aktsignaling[j].int j cancer,2019,144(9):2215-2226.doi:10.1002/ijc.31887.

8、ayoub c,wasylyk c,li y,et al.ano1 amplification and expression inhnscc with a high propensity for future distant metastasis and its functionsin hnscc cell lines[j].br j cancer,2010,103(5):715-26.doi:10.1038/sj.bjc.6605823

9、simon s,grabellus f,ferrera l,et al.dog1 regulates growth and igfbp5in gastrointestinal stromal tumors[j].cancer res,2013,73(12):3661-70.doi:10.1158/0008-5472.can-12-3839.

10、liu w,lu m,liu b,et al.inhibition of ca(2+)-activated cl(-)channelano1/tmem16a expression suppresses tumor growth and invasiveness in humanprostate carcinoma[j].cancer lett,2012,326(1):41-51.doi:10.1016/j.canlet.2012.07.015.

11、britschgi a,bill a,brinkhaus h,et al.calcium-activated chloridechannel ano1 promotes breast cancer progression by activating egfr and camksignaling[j].proc natl acad sci u s a,2013,110(11):e1026-34.doi:10.1073/pnas.1217072110.

技术实现思路

1、为了满足上述需求，本公开的目的在于特异性识别ano1的核酸适体及其衍生物、组合物、其筛选方法及其用途。

2、第一方面，本公开提供一种特异性识别ano1的核酸适体或其衍生物，其包含选自seq id no.1、2、3中任一项所示的核苷酸序列或与其具有85％以上序列同一性的核苷酸序列。

3、优选地，所述核酸适体为dna序列或rna序列。

4、优选地，所述核酸适体经过修饰，所述修饰为硫代磷酸酯修饰或糖环修饰。

5、优选地，所述核酸适体是经过序列转换的核酸适体；所述序列转换为将dna序列翻译为rna序列，和/或翻译成肽核酸序列。

6、优选地，所述核酸适体还包括所述核苷酸序列的至少一个位置的a、t、c或g被稀有碱基置换所得到的具有相同功能的核苷酸序列；更优选地，所述稀有碱基包括甲基化嘌呤、二氢嘧啶或次黄嘌呤、吉西他滨和5氟尿嘧啶。

7、优选地，所述核酸适体的核苷酸序列结合选自生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料、核素、放射药物或酶标记中的任一种标记物质。

8、第二方面，本公开提供一种上述的核酸适体的筛选方法，包括以下步骤：

9、s1.合成初始文库序列中的随机单链dna文库和引物；

10、s2.selex筛选，在上述s1步骤中获得的随机单链dna文库和引物中筛选所得对ano1蛋白具有特异性的核酸适体文库；

11、s3.pcr扩增初始文库，将上述s2步骤中筛选所得的对ano1蛋白具有特异性的性核酸适体文库进行pcr扩增；

12、s4.制备dna单链文库，从上述s3步骤扩增产物中分离出单链dna；

13、s5.重复所述s1-s4步骤，并将最终获得的产物进行筛选及测序，得到所述核酸适体。

14、第三方面，本公开提供一种组合物，所述组合物包含所述寡核苷酸或其药学上可接受的盐，以及任选地药学上可接受的载体。

15、第四方面，本公开提供了上述任一项所述核酸适体或其衍生物、或其药学上可接受的盐、或其组合物在制备用于缓解或治疗肿瘤的药物中的用途。

16、优选地，所述肿瘤为ano1阳性的癌症；更优选地，所述癌症包括直肠癌、头颈部鳞状细胞癌(hnscc)、乳腺癌、胃肠间质瘤、前列腺癌等。

17、第五方面，本公开提供了一种治疗肿瘤的方法，其包括向哺乳动物受试者施用治疗有效量的上述任一项所述核酸适体或其衍生物、或其药学上可接受的盐、或组合物；

18、其中所述肿瘤为ano1阳性的癌症；更优选地，所述癌症包括直肠癌、头颈部鳞状细胞癌(hnscc)、乳腺癌、胃肠间质瘤、前列腺癌等。

19、第六方面，本公开提供了上述任一项核酸适体或其衍生物、或其药学上可接受的盐、或其组合物在用于制备诊断或检测离体样本中ano1是否存在的检测试剂或试剂盒中的用途。

20、第七方面，本公开提供了一种检测来自哺乳动物的离体样本中是否存在ano1阳性的方法，其包括：

21、s1’.提供来自哺乳动物的离体样本，所述样本选自患有肿瘤的受试者的组织、细胞或体液；

22、s2’.提供上文任一项所述特异性识别ano1的核酸适体或其衍生物；

23、s3’.使所述特异性识别ano1的核酸适体或其衍生物与所述样本接触，测定ano1的表达水平。

24、第八方面，本公开提供了一种检测试剂，其至少包括作为有效活性组分的上述任一项核酸适体或其衍生物、或其药学上可接受的盐、或组合物。

25、第九方面，本公开提供了一种试剂盒，其至少包括作为有效活性组分的上述任一项核酸适体、或其衍生物、或其药学上可接受的盐、或组合物。

26、第十方面，本公开提供了一种核酸适体-药物偶联物，其包括spacer修饰的核酸适体或其衍生物，和其它药物；其中所述核酸适体为上述任一项所述的核酸适体，所述spacer包括疏水性的spacer c3、c6、c12，亲水性的spacer9、spacer 18，以及dspacer、pc linker。

27、进一步地，所述核酸适体-药物偶联物包括spacer修饰的核酸适体或其衍生物，和其它药物；

28、其中所述其它药物包括以下所列药物中的任一种药物：化疗药物，例如5-fu，吉西他滨，卡被他滨等；放疗药物；抗体药物；细胞毒性药物，例如mmae、mmaf、sn38等。

29、有益效果

30、通过多轮ano1蛋白筛选的方式获得靶向ano1的aptamer文库。通过高通量测序及分析，得到丰度最高的aptamer 96条。挑选进化较好的序列进行结合验证，得到亲和力较高的序列。

31、所述核酸适体具有很好的靶向ano1的能力，可用于ano1的靶向降解、靶向给药、检测分析等。

32、根据本公开的一些实施例，所述核酸适体seq1或其衍生物与ano1的亲和力为kd＝52.13nm。

33、通过本公开的一些实施方案，所述ano1蛋白的靶向治疗提供新的工具

34、通过本公开的一些实施方案，所述核酸适体或其衍生物能够有效降解ano1蛋白，为ano1阳性的相关疾病提供了新的方法和途径。

35、通过本公开的一些实施方案，为基于ano1的靶向治疗提供新可操作的治疗策略。