特异性识别EGFRL858R突变抗原的TCR及其用途的制作方法

本发明总体上涉及免疫学领域。具体地，本发明涉及特异性识别egfr l858r突变抗原的t细胞受体(下文中也缩写为tcr)、表达所述tcr的基因工程化细胞、以及制备所述基因工程化细胞的方法。本发明还提供了所述tcr和所述基因工程化细胞在检测、预防和/或治疗egfr l858r突变抗原相关的癌症中的用途。

背景技术：

1、人表皮生长因子受体(human epidermal receptor，her)家族属于四个密切相关的i型受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，rtk)家族的胞膜受体之一，与多种肿瘤的发生和发展密切相关。

2、her家族主要有四个结构类似的受体分子，包括表皮生长因子受体(epidermalgrowth factorreceptor，egfr，也称为erbb1，her1)、erbb2(也称为neu，her2)、erbb-3(her3)和erbb-4(her4)四个成员。egfr是i型跨膜糖蛋白，广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，通过与其配体例如egf和tgf-α结合而激活egfr信号通路，发挥对细胞的生长、增殖和分化等生理过程的重要作用。

3、在许多上皮细胞肿瘤中观察到egfr突变导致的egfr信号通路异常活化，所述上皮细胞肿瘤包括非小细胞肺癌(nsclc)、乳腺癌、神经胶质瘤、头颈鳞状细胞癌、结直肠癌、直肠腺癌(rectal adenocarcinoma)、头颈癌、胃癌、前列腺癌等。据报道，egfr蛋白的第858位氨基酸从l(亮氨酸)突变为r(精氨酸)占观察到的nsclc egfr突变的41％(petert.harrison等人，“rare epidermal growth factor receptor(egfr)mutations in non-small cell lung cancer”，seminars in cancer biology，2020，61：167-179)。结构学研究表明，在egfr l858r突变中，由于精氨酸的侧链比亮氨酸的侧链大得多，由此破坏了egfr的非活性构象，并将egfr的胞内激酶结构域“锁定”为组成型活性构象，导致了egfr的二聚化增加，且egfr发生组成型活化。

4、目前，针对egfr靶点开发的已上市药物主要为小分子酪氨酸激酶抑制剂(tki)和egfr单克隆抗体，其中，小分子酪氨酸激酶抑制剂(tki)已经有三代的发展历程，包括第一代吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼，第二代阿法替尼、达克替尼及第三代奥希替尼，研究表明，当将这些小分子酪氨酸激酶抑制剂(tki)用于患者时，观察到获得性耐药，导致基于药物结构的egfr继发性突变，并且还发现这是耐药性的主要原因。至于egfr单克隆抗体，例如西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、尼采珠单抗(necitumumab)均是通过阻断egfr受体的胞外配体结合区发挥抗肿瘤作用，它们对于egfr胞内段的结构改变如l858r突变所致的配体非依赖性酪氨酸激酶活化无法发挥抗肿瘤作用。

5、基于这些事实，以及肿瘤细胞发生egfr l858r突变后会表达正常细胞所没有的egfr l858r突变蛋白，所述突变蛋白在细胞内(肿瘤细胞或抗原呈递细胞)被蛋白酶酶解成肽段(抗原表位)，与mhc-i类或mhc-ii类分子结合后呈递到细胞表面，与t细胞受体结合，t细胞被激活；激活后的t细胞扩增，浸润肿瘤微环境，识别并杀伤肿瘤细胞，本领域需要开发出针对egfr l858r突变抗原的特异性免疫细胞，例如，tcr-t细胞，以避免小分子酪氨酸激酶抑制剂(tki)导致的耐药性，并有效检测、预防和治疗egfr l858r突变抗原相关的癌症。

技术实现思路

1、本发明人通过锐意研究，获得了能与egfr l858r突变抗原特异性结合的t细胞受体(tcr)，并制备了重组表达该tcr的淋巴细胞，由此，能够通过tcr与egfr l858r突变抗原特异性结合来检测哺乳动物中egfr l858r突变抗原相关的癌症存在；和/或能够通过体内介导针对表达egfr l858r突变抗原的靶细胞的免疫应答来杀伤表达egfr l858r突变抗原的癌细胞，从而满足了上述需求。

2、因此，在一个方面，本发明提供了分离的或纯化的t细胞受体(tcr)，其与egfrl858r突变抗原特异性结合，优选地，所述tcr包含α链和β链，其中所述α链和β链各包含三个互补决定区(cdr)，并且α链的cdr3的氨基酸序列选自seq id no：3、6、9、12、15、18、21、24、27、30和与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体，β链的cdr3的氨基酸序列选自seq id no：113、116、119、122、125、128、131、134、137、140和与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体。

3、在一个实施方案中，本发明的tcrα链的cdr3的氨基酸序列和β链的cdr3的氨基酸序列是：

4、(i)seq id no：3所示的α链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及seq id no：113所示的β链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；

5、(ii)seq id no：6所示的α链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及seq id no：116所示的β链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；

6、(iii)seq id no：9所示的α链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及seq id no：119所示的β链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；

7、(iv)seq id no：12所示的α链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及seq id no：122所示的β链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；

8、(v)seq id no：15所示的α链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及seq id no：125所示的β链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；

9、(vi)seq id no：18所示的α链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及seq id no：128所示的β链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；

10、(vii)seq id no：21所示的α链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及seq id no：13l所示的β链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；

11、(viii)seq id no：24所示的α链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及seq id no：134所示的β链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；

12、(ix)seq id no：27所示的α链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及seq id no：137所示的β链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；或

13、(x)seq id no：30所示的α链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及seq id no：140所示的β链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体。

14、在一个实施方案中，本发明的tcr的α链包含的三个互补决定区(cdr)的氨基酸序列和β链包含的三个cdr的氨基酸序列是：

15、(i)seq id no：1、2、3所示的α链cdr1、cdr2、cdr3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及seq id no：111、112、113所示的β链cdr1、cdr2、cdr3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；

16、(ii)seq id no：4、5、6所示的α链cdr1、cdr2、cdr3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及seq id no：114、115、116所示的β链cdr1、cdr2、cdr3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；

17、(iii)seq id no：7、8、9所示的α链cdr1、cdr2、cdr3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及seq id no：117、118、119所示的β链cdr1、cdr2、cdr3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；

18、(iv)seq id no：10、11、12所示的α链cdr1、cdr2、cdr3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及seq id no：120、121、122所示的β链cdr1、cdr2、cdr3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；

19、(v)seq id no：13、14、15所示的α链cdr1、cdr2、cdr3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及seq id no：123、124、125所示的β链cdr1、cdr2、cdr3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；

20、(vi)seq id no：16、17、18所示的α链cdr1、cdr2、cdr3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及seq id no：126、127、128所示的β链cdr1、cdr2、cdr3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；

21、(vii)seq id no：19、20、21所示的α链cdr1、cdr2、cdr3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及seq id no：129、130、131所示的β链cdr1、cdr2、cdr3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；

22、(viii)seq id no：22、23、24所示的α链cdr1、cdr2、cdr3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及seq id no：132、133、134所示的β链cdr1、cdr2、cdr3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；

23、(ix)seq id no：25、26、27所示的α链cdr1、cdr2、cdr3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及seq id no：135、136、137所示的β链cdr1、cdr2、cdr3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；或

24、(x)seq id no：28、29、30所示的α链cdr1、cdr2、cdr3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及seq id no：138、139、140所示的β链cdr1、cdr2、cdr3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体。

25、在一些实施方案中，本发明的tcr包含seq id no：91、93、95、97、99、101、103、105、107或109所示的α链序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；和seq id no：215、217、219、221、223、225、227、229、231或233所示的β链序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

26、在一些实施方案中，本发明提供了t细胞受体融合蛋白或t细胞受体缀合物，其包含本发明第一方面所述的tcr和其他生物活性分子，其中所述其他生物活性分子是例如抗体、细胞因子、细胞毒性剂、酶、放射性物质、可检测标记，其中所述tcr和其他生物活性分子之间具有或不具有接头。

27、本发明还提供了编码本发明tcrα链和/或β链的核酸。

28、此外，本发明提供了载体，优选地为质粒、穿梭质粒、噬菌粒、粘粒、表达载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体和/或同源重组修复(hdr)载体，其包含一个或多个如上所述的核酸。

29、在第二方面，本发明提供了用以上载体转化并表达本发明第一方面所述tcr的工程化细胞。

30、在一些实施方案中，本发明提供了一种不使用病毒载体表达本发明的外源性tcr的打靶策略来制备tcr-t细胞的方法。

31、在一些实施方案中，本发明提供了一种编辑人细胞基因组的方法，所述方法包括将以下核酸序列插入人细胞中内源性t细胞受体(tcr)α链恒定区基因的外显子1的靶区域中，所述核酸序列从n端到c端包含：

32、(i)编码第一可裂解接头多肽的序列；

33、(ii)编码本发明第一方面所述tcr的β链的序列；

34、(iii)编码第二可裂解接头多肽的序列；

35、(iv)编码本发明第一方面所述tcr的α链可变区的序列；

36、其中，所述第一可裂解接头多肽和所述第二可裂解接头多肽是相同或不同的病毒2a肽。

37、通过所述方法制备的表达外源性tcr的细胞与kitdfgrakl-hla-a*11：01复合物和/或kitdfgrak-hla-a*11：01有很高的结合亲和力以及对呈递seq id no：235所示的egfrl858r_852-861肽或seq id no：236所示的egfr l858r_852-860肽的t2细胞具有很强的体外杀伤作用。

38、在一些实施方案中，制备表达外源性tcr的细胞的方法是通过采用crispr/cas9技术和同源重组技术，敲除内源性tcr和敲入外源性tcr实施的。

39、在第三方面，本发明提供了第一方面所述的tcr和第二方面所获得的工程化细胞在检测、预防和/或治疗egfrl858r突变抗原相关的癌症中的用途。