α-酮戊二酸脱氢酶E1突变体及其应用的制作方法

本发明属于微生物工程，具体地说，涉及α-酮戊二酸脱氢酶e1突变体及其应用。

背景技术：

1、l-谷氨酰胺是一种非必需氨基酸。化学名称为2-氨基-4-氨甲酰基丁酸。l-谷氨酰胺是蛋白质合成中的编码氨基酸，可促进蛋白质的合成，抑制蛋白质的分解，可用于治疗胃及十二指肠溃疡，在医药行业中有重要作用。

2、目前，l-谷氨酰胺最常用的生产方法为发酵法，主要以谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)为生产菌发酵生产l-谷氨酰胺。谷氨酸棒状杆菌是异养需氧型，为革兰氏阳性菌，具有生长速度快、非致病、对自身代谢物弱降解能力的特性。发酵法具有原料来源广泛、生产成本低、产品质量可控、产物单一等优点。但目前生产l-谷氨酰胺的菌种的发酵性能仍较差，l-谷氨酰胺转化率不理想，工业上对l-谷氨酰胺的需求量极高，现有的菌种根本无法满足大规模工业化生产的需求。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供α-酮戊二酸脱氢酶e1突变体及其应用。

2、本发明的另一目的是提供一种l-谷氨酰胺产量提高的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用。

3、为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种α-酮戊二酸脱氢酶e1突变体，所述突变体包含α-酮戊二酸脱氢酶e1第356位氨基酸由r到除r之外的其他氨基酸的突变，优选由r到c、h、s或p的突变。

4、本发明中，α-酮戊二酸脱氢酶e1在ncbi上的参考序列编号为cey17_06180。由odha基因编码。

5、第二方面，本发明提供编码所述突变体的核酸分子。

6、第三方面，本发明提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组dna、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。

7、第四方面，本发明提供所述核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料的以下任一应用：

8、(1)用于l-谷氨酰胺以及以l-谷氨酰胺为前体的衍生物的发酵生产；

9、(2)用于构建产l-谷氨酰胺的工程菌。

10、本发明中，所述以l-谷氨酰胺为前体的衍生物包括但不限于精氨酸和核苷类产品。

11、第五方面，本发明提供一种产l-谷氨酰胺的工程菌的构建方法，利用基因工程手段，在具有l-谷氨酰胺生产能力的细菌基因组中引入突变，使其编码的α-酮戊二酸脱氢酶e1包含r356c、r356h、r356s或r356p突变位点。

12、本发明中，所述细菌包括但不限于棒杆菌属(corynebacterium)、埃希氏菌属(escherichia)或芽孢杆菌属(bacillus)菌种，如谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)、大肠杆菌(escherichia coli)或枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)等。

13、优选地，所述细菌为谷氨酸棒杆菌mhz-0513-3，保藏编号为cgmcc no.13405。菌株mhz-0513-3可以参见cn106701649a。

14、第六方面，本发明提供按照上述方法构建得到的工程菌。

15、第七方面，本发明提供所述工程菌在l-谷氨酰胺以及以l-谷氨酰胺为前体的衍生物的发酵生产中的应用。

16、第八方面，本发明提供一种生产l-谷氨酰胺以及以l-谷氨酰胺为前体的衍生物的方法，所述方法包括如下步骤：

17、a)培养所述工程菌，获得微生物的培养物；

18、b)从步骤a)中获得的所述培养物中收集所产生的l-谷氨酰胺以及以l-谷氨酰胺为前体的衍生物。

19、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

20、本发明首次发现，当odha基因编码蛋白的356位氨基酸由精氨酸(r)突变为半胱氨酸(c)、组氨酸(h)、丝氨酸(s)和脯氨酸(p)后，与出发菌株mhz-0513-3相比，l-谷氨酰胺产量均有提高。其中突变为半胱氨酸(c)后，l-谷氨酰胺产量由28.7g/l提高到31.5g/l，产酸提高9.8％；mhz-0513-3-odhar356h和mhz-0513-3-odhar356s的l-谷氨酰胺产量分别为32.0g/l、32.2g/l；当突变为脯氨酸(p)时，l-谷氨酰胺产量达到33.4g/l，产酸提高16.4％。该处点突变还可以用于其他谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等宿主菌中，应用于以l-谷氨酰胺为前体的衍生物的生产，如精氨酸和核苷类产品等，从而为大规模生产l-谷氨酰胺提供有效手段，应用前景广阔。

技术特征：

1.α-酮戊二酸脱氢酶e1突变体，其特征在于，所述突变体包含α-酮戊二酸脱氢酶e1第356位氨基酸由r到除r之外的其他氨基酸的突变，优选由r到c、h、s或p的突变；

2.编码权利要求1所述突变体的核酸分子。

3.含有权利要求2所述核酸分子的生物材料，所述生物材料为重组dna、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。

4.权利要求2所述核酸分子或权利要求3所述生物材料的以下任一应用：

5.产l-谷氨酰胺的工程菌的构建方法，其特征在于，利用基因工程手段，在具有l-谷氨酰胺生产能力的细菌基因组中引入突变，使其编码的α-酮戊二酸脱氢酶e1包含r356c、r356h、r356s或r356p突变位点；其中，α-酮戊二酸脱氢酶e1在ncbi上的参考序列编号为cey17_06180。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细菌为棒杆菌属(corynebacterium)、埃希氏菌属(escherichia)或芽孢杆菌属(bacillus)菌种；

7.按照权利要求5或6所述方法构建得到的工程菌。

8.权利要求7所述工程菌在l-谷氨酰胺以及以l-谷氨酰胺为前体的衍生物的发酵生产中的应用；

9.一种生产l-谷氨酰胺以及以l-谷氨酰胺为前体的衍生物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

技术总结本发明公开了α‑酮戊二酸脱氢酶E1突变体及其应用。本发明首次发现，当odhA基因编码蛋白的356位氨基酸由R突变为C、H、S和P后，与出发菌株MHZ‑0513‑3相比，L‑谷氨酰胺产量均有提高。其中R突变为C后，L‑谷氨酰胺产量由28.7g/L提高到31.5g/L，产酸提高9.8％；MHZ‑0513‑3‑odhAR356H和MHZ‑0513‑3‑odhAR356S的L‑谷氨酰胺产量分别为32.0g/L、32.2g/L；当R突变为P时，L‑谷氨酰胺产量达到33.4g/L，产酸提高16.4％。本发明为大规模生产L‑谷氨酰胺提供有效手段，应用前景广阔。技术研发人员：姚嘉琪,吴涛,栾明月,薛婷莉,张孟娟受保护的技术使用者：廊坊梅花生物技术开发有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/13