双链RNA的合成方法及RNA连接酶在双链RNA合成中的应用与流程

本发明涉及生物，具体而言，涉及一种双链rna的合成方法及rna连接酶在双链rna合成中的应用。

背景技术：

1、核糖核酸是存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。在很长的一段时间内，rna被认为只是在基因与蛋白质之间进行信息传递的分子。其实，在生命起源之初，rna是唯一的生命分子，既可储存信息，也具有酶的功能。rna除了充当蛋白质合成的信使之外(mrna)，还具有着非常重要的调控功能，非转录rna包括mirna，sirna，lncrna，piwirna等等。其中，仅mirna分子就有400多种，调控至少三分之一的人类基因。从20世纪70年代起，基因载体技术、基因克隆技术、基因编辑技术等给现代基因疗法技术带来了深刻的影响。同时rna编辑技术实现了从遗传水平对人体细胞中特定的核苷酸进行编辑，这一技术不仅可以用作研究工具，而且可作为由突变引发的疾病的临时治疗方法。

2、近年来，rna药物领域飞速发展，一方面是以sirna和aso为代表的小核酸药物在罕见病等领域大放异彩，另一方面是以mrna疫苗为代表的mrna药物在新冠疫情中发挥了重要的作用。上个世纪末首个小核酸药物fomivirsen获批上市以后，相关产业发展进入了一段“空窗期”。随着递送技术的进步，小核酸药物同样在近几年迎来了快速增长期。而这一阶段也酝酿出了小核酸药物的首个重磅炸弹药物nusinersen。该药由biogen开发，是一款反义寡核苷酸(aso)药物，用于治疗成人和儿童患者的脊髓性肌萎缩(sma)。

3、目前寡核苷酸(12-30个核苷酸)通用的合成方法多为固相合成法，而固相合成是将核酸固定在固相载体上完成合成反应的，最常用的固相载体为可控微孔玻璃珠(cpg)，但是载量有限，一般为70-80μmol/g。但是固相合成核苷酸链存在很大的缺点，合成链长受限，一般用于合成25个核苷酸以内的链长，随着合成链长的增加，产率降低，引物合成至～80nt链长时粗品纯度只有～40％，因此极大限制了核苷酸链的合成。

4、酶法催化合成是一种绿色高效的方式，反应条件比较温和，对有机试剂需求小甚至不需要有机试剂，因此是一种比较有前景的催化方式。利用连接酶合成核苷酸链，可以实现绿色催化，同时合成链长不受限制，可以解决固相合成的技术瓶颈。但文献或专利中对于酶法催化合成天然rna或非天然rna双链的报道几乎没有，尤其是对于非天然rna的双链合成更是很难做到。

技术实现思路

1、本发明旨在提供一种双链rna的合成方法及rna连接酶在双链rna合成中的应用，以解决现有技术中酶法催化合成天然rna或非天然rna双链难以完成的技术问题。

2、为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种双链rna的合成方法。该合成方法包括以下步骤：s1，合成单链rna片段；s2，将单链rna片段混合采用rna连接酶将单链rna片段连接形成双链rna；rna连接酶为来源为vibrio phage、escherichia phage、klebsiella phage、bacteriophage、thermophilic bacteriophage、acidobacteriabacterium、salmonellaenterica、yersiniaphagevb_yepm_zn18、shigellaphage pss-1或buttiauxella phage vb_butm_gul6的rna连接酶。

3、进一步地，单链rna片段的长度为3～200个核苷酸或其类似物。

4、进一步地，来源为vibrio phage的rna连接酶的氨基酸序列如seq id no：1、2、5、6、13、14、17或19所示；来源为escherichia phage的rna连接酶的氨基酸序列如seq id no：3或15所示；来源为klebsiella phage的rna连接酶的氨基酸序列如seq id no：4或16所示；来源为acidobacteriabacterium的rna连接酶的氨基酸序列如seq id no：7所示；来源为salmonellaenterica的rna连接酶的氨基酸序列如seq id no：8所示；来源为yersiniaphagevb_yepm_zn18的rna连接酶的氨基酸序列如seq id no：9所示；来源为shigella phage pss-1的rna连接酶的氨基酸序列如seq id no：10所示；来源为buttiauxella phage vb_butm_gul6的rna连接酶的氨基酸序列如seq id no：11所示，来源为bacteriophage的rna连接酶的氨基酸序列如seq id no：12所示；来源为thermophilicbacteriophage的rna连接酶的氨基酸序列如seq id no：18所示。

5、进一步地，双链rna为天然rna或非天然rna。

6、进一步地，具有戊糖环2’位修饰、3’位修饰、磷酸根α位修饰或碱基修饰中的一种或多种的核糖核苷酸；优选地，戊糖环2’位修饰包括2’-甲氧基修饰、2’-氟修饰、2’-三氟甲氧基修饰、2’-甲氧乙基修饰、2’-烯丙基修饰、2’-氨基修饰或2’-叠氮基修饰；优选地，磷酸根α位修饰包括磷酸根α位硫代修饰；优选地，碱基修饰包括在碱基的n1、n5或n6位中任意一处或多处进行的甲基化修饰和/或乙酰化修饰。

7、进一步地，单链rna片段为采用固相合成法合成。

8、进一步地，单链rna片段包括单链rna片段底物1～底物n及对应互补的单链rna片段底物n+1～底物n+n，其中，n≥2，互补的单链rna片段之间有≥3个核苷酸的碱基互补配对；底物2和底物n+1、底物n和底物n+n-1的5’端有≥2个核苷酸的碱基互补配对；可选的，底物1和底物n+1外侧的5’和3’端由化学键相连；可选的，底物n和底物n+n外侧的5’和3’端由化学键相连。

9、进一步地，s2的反应温度为0℃～60℃，优选为4℃～37℃，反应时间为0.5h～24h，ph为6～8.5。

10、根据本发明的另一方面，提供了一种rna连接酶在双链rna合成中的应用，其中，rna连接酶为来源为vibrio phage、escherichia phage、klebsiella phage、bacteriophage、thermophilic bacteriophage、acidobacteriabacterium、salmonellaenterica、yersiniaphagevb_yepm_zn18、shigella phage pss-1或buttiauxella phage vb_butm_gul6的rna连接酶。

11、进一步地，来源为vibrio phage的rna连接酶的氨基酸序列如seq id no：1、2、5、6、13、14、17或19所示；来源为escherichia phage的rna连接酶的氨基酸序列如seq id no：3或15所示；来源为klebsiella phage的rna连接酶的氨基酸序列如seq id no：4或16所示；来源为acidobacteriabacterium的rna连接酶的氨基酸序列如seq id no：7所示；来源为salmonellaenterica的rna连接酶的氨基酸序列如seq id no：8所示；来源为yersiniaphagevb_yepm_zn18的rna连接酶的氨基酸序列如seq id no：9所示；来源为shigella phage pss-1的rna连接酶的氨基酸序列如seq id no：10所示；来源为buttiauxella phage vb_butm_gul6的rna连接酶的氨基酸序列如seq id no：11所示，来源为bacteriophage的rna连接酶的氨基酸序列如seq id no：12所示；来源为thermophilicbacteriophage的rna连接酶的氨基酸序列如seq id no：18所示。

12、应用本发明的技术方案，能特异性拼接不同的核苷酸片段，能合成长片段核苷酸链，同时能催化天然核苷酸和非天然核苷酸的连接，解决了目前合成核苷酸链的技术难题。