基因工程改造的黑曲霉菌株的制作方法

本发明涉及微生物领域，更具体涉及基因工程改造的黑曲霉菌株及其制备方法，以及用该菌株生产外源蛋白的方法。

背景技术：

1、黑曲霉 ( aspergillus niger ) 属于子囊菌亚门、丛梗孢科、曲霉属真菌的常见种，也是自然界中最为常见的丝状真菌，在植物性产品、粮食和土壤中广泛分布。其分生孢子头为黑褐色放射状，球状顶囊，分生孢子梗长短不一，菌丝发达，多分支。黑曲霉能够通过降解自然界中的有机质并吸收其中的营养物质而快速生长，黑曲霉被美国食品与药品管理局（fda）列为gras( generally regards as safe) 级别并得到了世界卫生组织的认可，是丝状真菌中应用非常普遍的种属。由于黑曲霉能够产生酶制剂和有机酸，因而成为重要的工业生产菌株。

2、黑曲霉具有高效的蛋白分泌表达能力。黑曲霉表达外源蛋白具有表达量大、胞外分泌率高、蛋白质分子折叠和修饰系统接近高等真核细胞等特点，且表达的外源蛋白具有天然活性。另外，黑曲霉还能进行各种翻译后加工，如糖基化修饰蛋白酶切割和二硫键的形成等。因而，利用黑曲霉作为一个表达菌株来表达同源和异源蛋白日益受到重视。目前利用黑曲霉生产的商业酶制剂包括食品、洗涤、纺织和造纸等工业中用到的淀粉酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、植酸酶和木聚糖酶等，通过其表达的异源蛋白有溶菌酶、白细胞介素-6、人乳铁蛋白、牛凝乳酶、奇异果甜蛋白、脂肪酶等。

3、在中国应用于食品中的酶制剂必须符合中华人民共和国国家标准gb2760-食品国家标准\食品添加剂使用标准，其中符合法规的异源表达食品用溶血磷脂酶（黑曲霉来源）只能由黑曲霉来进行异源表达。

4、因此，本领域仍然需要能够高效表达各种蛋白，特别是各种酶的黑曲霉菌株。

技术实现思路

1、本发明以购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（简称cicc）、菌株保藏编号为cicc2243的黑曲霉作为初始菌株。利用农杆菌转化的方法构建了重组表达溶血磷脂酶（lpl）的基因单拷贝菌株。在单拷贝菌株筛选过程中获得了黑曲霉转化子e13，其表现为与其它lpl单拷贝菌株相比，e13的lpl的酶活为其它菌株的2.63倍。

2、由于农杆菌介导转化是将lpl基因片段随机插入到黑曲霉的基因组dna中，所以认为e13菌株的插入位点的基因失活可能对重组蛋白表达具有显著的提升效果。于是通过tail pcr寻找到在菌株e13中lpl表达框插入的位点。测序结果显示，lpl表达框插入在蛋白酶体亚基rpn13基因中。蛋白酶体亚基rpn13是一种新型的泛素受体，是真核生物中选择性蛋白质降解的关键介质。

3、最后在黑曲霉cicc2243其它lpl单拷贝菌株和其它黑曲霉菌株（黑曲霉cicc2190和 黑曲霉 cicc2212）中，将rpn13进行失活验证，结果同样发现失活rpn13基因后，lpl有明显的提升现象，从而证明在黑曲霉中失活rpn13基因可以作为一种提高蛋白表达的优化策略，尤其是食品用溶血磷脂酶的表达。

4、具体地，本发明涉及以下方面：

5、一方面，本发明涉及基因工程改造的黑曲霉菌株，其与天然黑曲霉菌株相比，外源蛋白，例如酶，特别是溶血磷脂酶的生产能力提高至1.5倍以上，例如1.9-3.0倍，特别是2.2-2.7倍。

6、在一个实施方案中，本发明的基因工程改造的黑曲霉菌株与天然黑曲霉菌株相比，rpn13基因失活。

7、在一个实施方案中，rpn13基因失活是通过敲除rpn13基因或对rpn13基因进行rna干扰而实现的。

8、在一个实施方案中，敲除rpn13基因的方法可采用本领域的常规方法，例如，包括但不限于同源重组技术、zen技术、talen技术、cre/lox技术、crispr-cas9技术等。

9、在一个实施方案中，对rpn13基因进行rna干扰的方法可采用本领域的常规方法，例如，包括但不限于sirna、mirna等。

10、在一个实施方案中，作为本发明的基因工程改造的黑曲霉菌株的初始菌株的天然黑曲霉菌株选自黑曲霉cicc2243、黑曲霉cicc2190 和黑曲霉 cicc2212。

11、另一方面，本发明涉及生产本发明的菌株的方法，其包括使天然黑曲霉菌株的rpn13基因失活。

12、在一个实施方案中，rpn13基因失活是通过敲除rpn13基因或对rpn13基因进行rna干扰而实现的。

13、在一个实施方案中，敲除rpn13基因的方法可采用本领域的常规方法，例如，包括但不限于同源重组技术、zen技术、talen技术、cre/lox技术、crispr-cas9技术等。

14、在一个实施方案中，对rpn13基因进行rna干扰的方法可采用本领域的常规方法，例如，包括但不限于sirna、mirna等。

15、 在一个实施方案中，作为本发明的基因工程改造的黑曲霉菌株的初始菌株的天然黑曲霉菌株选自黑曲霉cicc2243、黑曲霉cicc2190 和黑曲霉 cicc2212。

16、本发明的基因工程改造的黑曲霉菌株能够高效表达异源蛋白。本发明的基因工程改造的黑曲霉菌株可以用于表达广泛的异源蛋白，如淀粉酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、植酸酶、木聚糖酶、溶菌酶、白细胞介素-6、人乳铁蛋白、牛凝乳酶、奇异果甜蛋白、脂肪酶等。特别地，本发明的基因工程改造的黑曲霉菌株在重组表达溶血磷脂酶时，可以比出发菌株的表达水平提高至1.5倍以上，例如1.9-3.0倍，特别是2.2-2.7倍。因此，该菌株具有显而易见的高效表达异源蛋白的实用性。

17、另一方面，本发明涉及重组黑曲霉菌株，其通过在本发明的基因工程改造的黑曲霉菌株中引入编码外源蛋白的基因而获得。

18、在一个实施方案中，所述外源蛋白是酶和其它蛋白，例如淀粉酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、植酸酶、木聚糖酶、溶菌酶、白细胞介素-6、人乳铁蛋白、牛凝乳酶、奇异果甜蛋白、脂肪酶等，特别是溶血磷脂酶。

19、另一方面，本发明涉及生物催化剂，其包含本发明的基因工程改造的黑曲霉菌株或本发明的重组黑曲霉菌株。

20、另一方面，本发明涉及生产目标蛋白的方法，包括将编码所述目标蛋白的基因引入本发明的基因工程改造的黑曲霉菌株，并且培养所述菌株以产生目标蛋白，或者培养本发明的重组黑曲霉菌株以产生目标蛋白。

21、在一个实施方案中，所述目标蛋白是酶和其它蛋白，例如淀粉酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、植酸酶、木聚糖酶、溶菌酶、白细胞介素-6、人乳铁蛋白、牛凝乳酶、奇异果甜蛋白、脂肪酶等，特别是溶血磷脂酶。

22、本发明还涉及重组微生物细胞，其中引入了源自本发明的黑曲霉菌株的菌内成分。在获得本发明的菌株后，可以通过常规技术分离其菌内成分，并且将所述成分引入其它微生物。引入所述成分的重组微生物细胞具有本发明所述菌株的优良性能。在本发明中，术语“菌内成分”指的是指生物体所有遗传物质的总和，具体而言，包括但不限于：编码dna和非编码dna、线粒体dna。

23、具体地，本发明的基因工程改造的黑曲霉菌株能够用于表达外源蛋白。在获得了本发明的基因工程改造的黑曲霉后，可以将常用的表达载体引入其中，用于表达外源蛋白。例如，表达载体中可以包含启动子和终止子，在启动子和终止子之间具有多克隆位点，可以插入编码外源蛋白的基因。启动子中可以包含一个或多个拷贝的增强子。许多商业载体都可以用于本发明的基因工程改造的黑曲霉菌株中进行外源蛋白的表达。

24、在表达非黑曲霉来源的外源蛋白时，某些物种的密码子可能在黑曲霉中是稀有的密码子。因此，在引入表达载体时，可以先对编码外源蛋白的基因进行适合本发明的黑曲霉的密码子优化，从而增加表达量。

25、本发明的黑曲霉可以表达多种外源蛋白，包括食品用酶，如食品用脂肪酶、药用蛋白、来自植物、动物和细菌的各种酶、膜受体蛋白、含辅基的蛋白以及可用于研究晶体结构的蛋白等。本发明的表达外源酶组分的黑曲霉还可以以全细胞作为生物催化剂。