产生烟酰胺单核苷酸的方法及由此获得的细胞及其应用与流程

本发明属于生物，更具体而言，本发明涉及一种产生烟酰胺单核苷酸(nmn)的方法。

背景技术：

1、烟酰胺单核苷酸(nmn)是哺乳动物体内辅酶i-nad+的重要前体，研究表明，烟酰胺单核苷酸在延缓衰老、治疗帕金森等老年病、调节胰岛素分泌、调控mrna的表达等方面具有显著效果。近年的研究进一步发现，人为补充nmn可以修复脑损伤、改善胰岛功能、保护心脏免于缺血再灌注损伤、修复脑线粒体呼吸缺陷，对老年退行性疾病、视网膜退行性疾病等均具有一定治疗作用，因此nmn在药物、保健品领域具有广阔的应用前景。

2、nmn的现有化学合成主要以烟酰胺、三苯甲酰基-β-d-核糖、四乙酰核糖等为原料，通过糖基化、磷酸化、氨解等关键步骤合成。具体可以分为溴代乙酰核糖法、tmsotf催化缩合法、amp酸水解催化法、缩酮化保护合成法和烟酸乙酯为原料的合成方法。但化学合成法中往往存在成本较高且产生手性化合物的问题。此外，化学合成法的反应步骤较多、nmn得率低、产品纯度低，而且需要用到大量的有机溶剂，对环境破坏严重。因此，化学法合成nmn在实际应用中存在很大局限。

3、相较化学合成法，生物合成法具有价格低廉、绿色环保无公害、适宜大规模工业化生产等优点。nmn的生物合成技术路径包括酶法合成及发酵合成。nmn酶法合成主要路线主要是模仿生物体内nad+和nmn的反应路径。现有技术中在大肠杆菌和酵母中对nmn的发酵合成进行了探索研究。marinescu等人构建基因工程菌发酵合成nmn，该团队将烟酰胺磷酸核糖转移酶和5’-磷酸核糖-1’-焦磷酸(phosphoribosyl pyrophosphate，prpp)合成酶在大肠杆菌中重组表达，以尼克酰胺和乳糖为底物进行发酵生产，但最终nmn产量仅为15.4mg/l。2020年，black等人研究设计大肠杆菌全细胞的从头生物合成途径，虽然不需要额外辅助因子添加，但nmn产量也仅有1.5mmol/l。2021年，shoji等构建了可以摄入葡萄糖和烟酰胺的基因工程重组大肠杆菌，含有不同物种来源的烟酸转运蛋白、烟酰胺核苷转运蛋白以及nampt酶，最终可使nmn产量达到6.79g/l。

4、烟碱又名尼古丁(nicotine)，为烟草中最主要的生物碱占总生物碱含量的90％左右。烟碱的骨架结构由吡啶环(pyridine)和吡咯烷(pyrrolidine)组合而成。吡啶环的最初前体为烟酸(nicotinic acid)，由烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adeninedinucleotide，nad)合成通路生成，而吡咯烷(pyrrolidine)的最初前体为n-甲基吡咯啉鎓(n-methylpyrrolinium)阳离子，由多胺合成通路生成。然而，自烟酸和n-甲基吡咯啉鎓阳离子后的详细反应步骤目前仍不清晰，已知由异黄酮还原酶和小檗碱桥接酶两种酶参与催化反应最终生成烟碱(图1)。而烟酸和目标产物nmn均参与nad代谢通路。

5、目前nmn的主要生物合成方法为以烟酰胺、atp和核糖或是烟酰胺和prpp作为底物进行体外催化(图2)。此类方法需要首先在重组大肠杆菌或其他重组底盘细胞中表达催化酶并进行纯化，步骤繁琐并且所用的底物价格较高且来源受限。若采用black等人的方法直接利用重组大肠杆菌进行从头生物合成，虽然不需要添加额外物料于培养液中，但nmn产量很低。shoji等人构建的可以摄入烟酰胺的重组大肠杆菌虽然可以提高最终nmn产量，但依然需要在培养液中额外添加烟酰胺，从而增加了生产成本。

6、因此，本领域亟需一种产生nmn的方法，不需要在大肠杆菌或其他模式微生物中表达及纯化nmn相关合成酶，也不需要额外添加昂贵底物，从而以简便且高效同时又能降低生产成本的方式大规模地生产nmn。

技术实现思路

1、如上所述，现有的产生nmn的方法仍存在工艺繁琐、成本高昂等多种不足。因此，本领域亟需一种产生nmn的方法，可以简便、高效、低成本的大规模生产nmn。

2、有鉴于此，在第一方面，本发明提供了一种产生烟酰胺单核苷酸(nmn)的方法，所述方法通过阻断积累烟碱的植物或细胞内的烟碱合成通路，使得所述烟碱合成通路中的烟酸合成相关代谢产物回流至烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)代谢通路从而积累产生nmn。

3、在一些实施方案中，所述积累烟碱的植物包括茄科烟草属的烟草；所述积累烟碱的细胞包括烟草细胞系。

4、在一些实施方案中，可以通过基因编辑、育种、t-dna插入和/或使用突变剂来阻断烟碱合成通路。

5、在一些实施方案中，可以通过敲除烟碱合成通路中一个或多个酶的编码基因来阻断烟碱合成通路。

6、在一个优选的实施方案中，可以通过敲除烟碱合成通路中a622酶和a622-like酶的编码基因来阻断烟碱合成通路。在另一个优选的实施方案中，可以进一步敲除烟碱合成通路中的小檗碱桥接酶(bbl)的编码基因。

7、在一些实施方案中，敲除烟碱合成通路中所述酶的编码基因具体包括以下步骤：

8、1)针对所述酶的编码基因设计靶序列，接着合成与靶序列对应的正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列，再经退火处理获得双链dna片段作为插入片段，将所述插入片段克隆至载体中，获得烟碱合成通路中所述酶基因编辑载体；

9、2)用所述酶基因编辑载体转化所述积累烟碱的植物或细胞。

10、在一些实施方案中，所述编码基因为seq id no:1和seq idno:2所示的a622基因和a622l基因，针对所述编码基因的靶序列为共同靶向a622基因和a622l基因的seq id no:3所示的序列。

11、在第二方面，本发明提供了一种产生nmn的细胞，其中，所述细胞内的烟碱合成通路被阻断，使得所述烟碱合成通路中的烟酸合成相关代谢产物回流至nad代谢通路从而积累产生nmn。

12、在一些实施方案中，所述细胞包括植物细胞。

13、本发明的有益效果如下：

14、1)简单、高效且生产成本低，无需要额外添加相关原料；

15、2)可以利用植物或植物细胞作为底盘进行大规模生产；

16、3)可以利用已有的植物栽培的成熟体系，无需对生产体系进行生产优化。

技术特征：

1.一种产生烟酰胺单核苷酸(nmn)的方法，所述方法通过阻断积累烟碱的植物或细胞内的烟碱合成通路，使得所述烟碱合成通路中的烟酸合成相关代谢产物回流至烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)代谢通路从而积累产生nmn。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述积累烟碱的植物包括茄科烟草属的烟草，例如k326或红花大金元等；所述积累烟碱的细胞包括烟草细胞系，如by-2细胞。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，通过基因编辑、育种例如杂交育种、t-dna插入和/或使用突变剂来阻断烟碱合成通路。

4.根据权利要求1-3所述的方法，其中，通过敲除烟碱合成通路中一个或多个酶例如异黄酮还原酶、小檗碱桥接酶(bbl)的编码基因来阻断烟碱合成通路。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，通过敲除烟碱合成通路中a622酶和a622-like酶的编码基因来阻断烟碱合成通路。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，进一步敲除烟碱合成通路中的小檗碱桥接酶的编码基因。

7.根据权利要求4-6所述的方法，其中，敲除烟碱合成通路中所述酶的编码基因具体包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述编码基因为seq idno:1和seq id no:2所示的a622基因和a622l基因，针对所述编码基因的靶序列为共同靶向a622基因和a622l基因的seq id no:3所示的序列。

9.一种产生nmn的细胞，其中，所述细胞内的烟碱合成通路被阻断，使得所述烟碱合成通路中的烟酸合成相关代谢产物回流至nad代谢通路从而积累产生nmn。

10.根据权利要求9所述的细胞，其中，所述细胞包括植物细胞，例如烟草细胞系，优选为by-2细胞。

技术总结本发明属于生物技术领域，更具体而言，本发明涉及一种产生烟酰胺单核苷酸(NMN)的方法、产生NMN的细胞以及其应用。通过本发明提供的产生NMN的方法，可以在不额外添加相关原料的情况下，简单、高效且低成本的大规模生产NMN。技术研发人员：李燕莉,丘璨瑜,王淑洁,赵山岑受保护的技术使用者：深圳华大生命科学研究院技术研发日：技术公布日：2024/6/13